Lada raven concept: увидим ли мы его в ближайшем будущем? :: SYL.ru

В сочетании с достижениями в области импульсных лазеров, оптики микроскопов и компьютерных технологий визуализации разработка методов маркировки, в которых донорные и акцепторные флуорофоры фактически являются частью самих биомолекул, позволила визуализировать динамические взаимодействия белков в живых клетках.В дополнение к исследованию взаимодействий белковых партнеров, недавние применения флуоресцентного резонансного переноса энергии включают исследования активности протеаз, изменений потенциалов мембранного напряжения, метаболизма кальция и проведение высокопроизводительных скрининговых анализов, таких как количественная оценка экспрессии генов в одиночные живые клетки.

Принципы передачи энергии резонанса флуоресценции

Процесс резонансной передачи энергии ( RET ) может происходить, когда донорный флуорофор в электронно возбужденном состоянии передает свою энергию возбуждения ближайшему хромофору, акцептору.В принципе, если спектр излучения флуоресценции молекулы-донора перекрывает спектр поглощения молекулы-акцептора, и они находятся в пределах минимального пространственного радиуса, донор может напрямую передавать свою энергию возбуждения акцептору через диполь-дипольные межмолекулярные соединения на большие расстояния. связь. Теория, предложенная Теодором Ферстером в конце 1940-х годов, первоначально описывала молекулярные взаимодействия, участвующие в резонансной передаче энергии, и Ферстер также разработал формальное уравнение, определяющее взаимосвязь между скоростью передачи, межхромофорным расстоянием и спектральными свойствами задействованных хромофоров.

Резонансная передача энергии — это безызлучательный квантово-механический процесс, который не требует столкновений и не требует выделения тепла. Когда происходит передача энергии, молекула-акцептор гасит флуоресценцию молекулы-донора, и если акцептор сам является флуорохромом, наблюдается усиленное или сенсибилизированное излучение флуоресценции (см. Рисунок 3). Это явление можно наблюдать, возбуждая образец, содержащий как донорные, так и акцепторные молекулы, светом с длинами волн, соответствующими максимуму поглощения донорного флуорофора, и детектируя свет, излучаемый на длинах волн с центром вблизи максимума излучения акцептора.Альтернативный метод обнаружения, быстро набирающий популярность, заключается в измерении времени жизни флуоресценции донорного флуорофора в присутствии и в отсутствие акцептора.

На рисунке 3 представлена ​​диаграмма Яблонского, иллюстрирующая связанные переходы между излучением донора и поглощением акцептора в резонансной передаче энергии флуоресценции. Абсорбционные и эмиссионные переходы представлены прямыми вертикальными стрелками (зелеными и красными соответственно), а колебательная релаксация обозначена волнистыми желтыми стрелками.Связанные переходы изображены пунктирными линиями, что указывает на их правильное расположение на диаграмме Яблонского, если они возникли в результате опосредованных фотонами электронных переходов. В присутствии подходящего акцептора донорный флуорофор может передавать энергию возбужденного состояния непосредственно акцептору, не испуская фотон (показано синей стрелкой на рисунке 3). Результирующее излучение сенсибилизированной флуоресценции имеет характеристики, аналогичные спектру излучения акцептора.

Чтобы произошла резонансная передача энергии, необходимо выполнить несколько критериев.В дополнение к перекрывающимся спектрам излучения и поглощения донорных и акцепторных молекул, два задействованных флуорофора должны располагаться на расстоянии от 1 до 10 нанометров друг от друга. Как описано в уравнениях, выведенных Ферстером (и обсуждаемых ниже), эффективность передачи энергии между молекулами донора и акцептора уменьшается в шестой степени расстояния, разделяющего их. Следовательно, способность донорного флуорофора передавать свою энергию возбуждения акцептору за счет безызлучательного взаимодействия резко снижается с увеличением расстояния между молекулами, ограничивая явление FRET максимальным радиусом разделения донор-акцептор примерно 10 нанометрами.На расстояниях менее 1 нанометра возможны несколько других режимов передачи энергии и / или электронов. Зависимость процесса резонансной передачи энергии от расстояния является основной основой его полезности при исследовании молекулярных взаимодействий. В исследованиях живых клеток с участием молекул, меченных донорными и акцепторными флуорофорами, резонансная передача энергии будет происходить только между молекулами, которые находятся достаточно близко, чтобы биологически взаимодействовать друг с другом.

Дополнительным требованием для резонансного переноса энергии является то, что время жизни флуоресценции донорной молекулы должно быть достаточным для того, чтобы событие могло произойти.Как скорость ( K (T) ), так и эффективность ( E (T) ) передачи энергии напрямую связаны со временем жизни донорного флуорофора в присутствии и в отсутствие акцептора. Согласно теории Ферстера, подтвержденной экспериментально, скорость передачи энергии определяется уравнением:

, где R (0) — критическое расстояние по Ферстеру, , t (D) — время жизни донора в отсутствие акцептора, а r — расстояние, разделяющее донорные и акцепторные хромофоры.Критическое расстояние Ферстера ( R (0) ) определяется как радиус разделения акцептор-донор, для которого скорость передачи равна скорости распада донора (снятия возбуждения) в отсутствие акцептора. Другими словами, когда радиус донора и акцептора ( r ) равен расстоянию Ферстера, то эффективность переноса составляет 50 процентов. На этом радиусе разделения половина энергии возбуждения донора передается акцептору за счет резонансной передачи энергии, а другая половина рассеивается за счет комбинации всех других доступных процессов, включая излучение флуоресценции.

По идее, критическое расстояние Ферстера — это максимальная длина разделения между донорными и акцепторными молекулами, при которой все еще будет происходить резонансная передача энергии. Значение критического расстояния обычно находится в диапазоне от 2 до 6 нанометров, что, к счастью, порядка многих размеров молекул белка. Кроме того, диапазон критических расстояний также соответствует нескольким другим биологически значимым параметрам, таким как толщина клеточной мембраны и расстояние, разделяющее сайты на белках, имеющих несколько субъединиц.Значение R (0) (в нанометрах) можно рассчитать из следующего выражения:

, в котором k-квадрат — коэффициент, описывающий относительную ориентацию в пространстве между диполями перехода донора и акцептора, Дж (1) — интеграл перекрытия в области спектров излучения донора и поглощения акцептора (с длина волны, выраженная в нанометрах), ч представляет показатель преломления среды, а Q (D) представляет собой квантовый выход донора.

Эффективность передачи энергии, E (T) , является мерой доли фотонов, поглощенных донором, которые передаются акцептору, и связана с расстоянием разделения донора и акцептора, r , посредством уравнение:

и E (T) оценивается как:

, где t (DA) — время жизни донора в присутствии акцептора, а t (D) — время жизни донора в отсутствие акцептора.Следовательно, измеряя время жизни донорной флуоресценции в присутствии и в отсутствие акцептора (что указывает на степень тушения донора из-за акцептора), можно определить расстояние, разделяющее молекулы донора и акцептора. Во многих обычно применяемых методах эффективность передачи энергии определяется путем измерения в установившемся режиме относительной средней интенсивности флуоресценции донора в присутствии и в отсутствие акцептора (а не путем измерения времени жизни).

Таким образом, скорость передачи энергии зависит от степени спектрального перекрытия между спектрами излучения донора и спектров поглощения акцептора (см. Рисунок 4), квантового выхода донора, относительной ориентации дипольных моментов переходов донора и акцептора и расстояние, разделяющее молекулы донора и акцептора. Любое событие или процесс, которые влияют на расстояние между донором и акцептором, будут влиять на скорость резонансной передачи энергии, что позволяет количественно оценить явление при условии, что артефакты можно контролировать или устранять.

На рисунке 4 представлены спектры поглощения и излучения голубого флуоресцентного белка ( CFP , донор) и красного флуоресцентного белка ( RFP или DsRed , акцептор) в сравнении с их потенциальным применением в качестве энергии резонанса флуоресценции. передаточная пара. Спектры поглощения обоих биологических пептидов показаны красными кривыми, а спектры эмиссии представлены синими кривыми. Область перекрытия спектров излучения донора и поглощения акцептора представлена ​​серой областью у основания кривых.Когда спектральное перекрытие молекул слишком сильно увеличивается, возникает явление, известное как спектральное просачивание или кроссовер , в котором сигнал от возбужденного акцептора (возникающий из возбуждающего освещения донора) и излучение донора обнаруживаются в акцепторный канал излучения. В результате получается высокий фоновый сигнал, который необходимо выделить из излучения слабой флуоресценции акцептора.

Основная теория безызлучательного переноса энергии напрямую применима к паре донор-акцептор, разделенной фиксированным расстоянием, и в этом случае скорость передачи энергии является функцией расстояния Ферстера, R (0) , которое в поворот зависит от k -квадрат, J (l) , h и Q (D) .Если эти факторы известны, можно рассчитать расстояние между донором и акцептором. Для описания таких ситуаций, как множественные акцепторные хромофоры и распределения расстояний, требуются более сложные формулировки. В таблице 1 представлена ​​серия экспериментально измеренных критических расстояний Ферстера, которые были определены из спектрального перекрытия нескольких популярных пар донорно-акцепторных флуорофоров. Поскольку переменная включает в себя выход донорного кванта и степень спектрального перекрытия, оба из которых зависят от локализованных условий окружающей среды, значения расстояния Ферстера должны определяться в тех же экспериментальных условиях, что и те, которые используются для исследования резонансного переноса энергии.

Показатель преломления среды передачи энергии обычно известен из состава растворителя или может быть оценен для конкретной макромолекулы и обычно принимается равным 1,4 в водном растворе. Квантовый выход донора определяется путем сравнения со стандартными флуорофорами с известным квантовым выходом. Поскольку Q (D) появляется как шестой корень при вычислении R (0) , небольшие ошибки или неточности в значении Q (D) не имеют большого влияния на вычисление расстояния Ферстера.Также из-за зависимости от корня шестой степени, R (0) не сильно зависит от вариаций J (l) , но интеграл перекрытия все равно должен оцениваться для каждой пары донор-акцептор. В общем, более высокая степень перекрытия между спектром излучения донора и спектром поглощения акцептора дает более высокие значения критического расстояния Ферстера.

Критическое расстояние Frster для обычных пар донор-акцептор RET

Неопределенность в оценке фактора ориентации ( k -квадрат) широко обсуждалась в литературе, и, несмотря на экспериментальные доказательства того, что теория Ферстера действительна и применима к измерению расстояний, эта переменная по-прежнему вызывает споры.Важно понимать, что расстояния Ферстера обычно даются для предполагаемого значения k в квадрате, обычно это динамически усредненное значение 2/3 (0,67). Это предполагаемое значение является результатом рандомизации ориентации донора и акцептора за счет вращательной диффузии до передачи энергии. Фактор ориентации зависит от относительной ориентации в пространстве диполя излучения донора и диполя поглощения акцептора и может варьироваться от нуля до 4. Значение 1 соответствует параллельным диполям перехода, а значение 4 соответствует диполям, которые оба являются параллельные и коллинеарные.

Из-за отношения корня шестой степени к расстоянию Ферстера изменение коэффициента ориентации от 1 до 4 приводит к изменению рассчитанного расстояния только на 26 процентов, а максимальная погрешность в 35 процентов возможна, когда обычно принимается значение 0,67. применены. Наиболее серьезная потенциальная ошибка возникает, если диполи ориентированы точно перпендикулярно друг другу и соответствующее значение k в квадрате становится равным нулю. Было использовано несколько методов работы с неопределенностью, включая предположение о том, что существует ряд статических ориентаций, которые не изменяются в течение времени жизни флуорофора в возбужденном состоянии.Измерения анизотропии флуоресценции для донора и акцептора могут позволить определить пределы для вариации k в квадрате. Кроме того, использование флуорофоров с низкой поляризацией флуоресценции (из-за излучения нескольких перекрывающихся переходов) снижает неопределенность фактора ориентации. Ограничение возможных значений k в квадрате таким образом снижает потенциальную ошибку вычисления расстояния до 10 процентов.

Во многих случаях фактор ориентации трудно, если не невозможно, определить, а точное значение переменной часто рассматривается как непреодолимая проблема.Однако некоторые свидетельства указывают на ограничение важности фактора в расчетах резонансной передачи энергии. Сравнение донорных и акцепторных расстояний с использованием спектроскопии резонансного переноса энергии и рентгеновской дифракции в значительной степени подтверждает обоснованность принятия значения 0,67 для фактора (как предложено теорией Ферстера), по крайней мере, для небольших пептидов и белков. Больше неопределенности существует для более крупных белков. Использование этого значения для фактора ориентации допустимо при предположении, что зонды донора и акцептора могут свободно совершать неограниченное изотропное движение.Дальнейшее обоснование получено из экспериментальных доказательств того, что для флуорофоров, прикрепленных одинарной или двойной связью к макромолекулам, сегментарные движения донора и акцептора имеют тенденцию приводить к динамически рандомизированным ориентациям.

Для слабосвязанных флуорохромов свободное вращательное движение вокруг одинарных связей должно позволить использовать среднее значение ориентации, но неограниченное движение молекул, связанных через несколько сайтов связывания, вероятно, не происходит.С другой стороны, крайние значения нуля и 4 для k -квадрат требуют полной флуоресцентной поляризации донора и акцептора, а это условие маловероятно. Статистические расчеты были представлены некоторыми исследователями, которые утверждают, что расстояния распределения донор-акцептор и их ориентация определяют наблюдаемое среднее расстояние. При условии, что наблюдается некоторое распределение наблюдаемого расстояния (и это не ограничивается слишком близким расположением донора и акцептора относительно R (0) ), можно надежно получить среднее расстояние между флуорофорами и оценить погрешность из-за фактора ориентации. .

Зависимость фактора ориентации ( k -квадрат) от относительной ориентации диполя излучения донора и диполя поглощения акцептора (проиллюстрирована на рисунке 5) дается уравнением:

где q (T) — угол между диполем эмиссионного перехода донора и диполем абсорбционного перехода акцептора, q (D) и q (A) — углы между этими диполями и вектором соединяющий донор и акцептор, а f — угол между плоскостями, содержащими два переходных диполя.

Эффективность передачи энергии наиболее чувствительна к изменениям расстояния, когда расстояние между донорами и акцепторами приближается к расстоянию Ферстера ( R (0) ) для двух молекул. Рисунок 6 иллюстрирует экспоненциальную зависимость между эффективностью переноса и расстоянием, разделяющим донор и акцептор. Эффективность быстро увеличивается до 100 процентов, когда расстояние разделения уменьшается ниже R (0) , и, наоборот, уменьшается до нуля, когда r больше, чем R (0) .Из-за сильной (в шестой степени) зависимости эффективности переноса от расстояния измерения расстояния разделения донора и акцептора надежны только тогда, когда радиус донора и акцептора находится в пределах расстояния Ферстера в два раза. Когда r составляет примерно 50 процентов от R (0) , эффективность резонансной передачи энергии близка к максимальной, и более короткие расстояния не могут быть надежно определены. Когда расстояние донор-акцептор превышает значение R (0) на 50 процентов, наклон кривой настолько пологий, что более длинные разделительные расстояния не разрешаются.

Практическое значение знания критического расстояния Ферстера заключается в том, что это значение дает представление о диапазоне расстояний разделения, которые могут быть определены FRET для данной пары датчиков (см. Таблицу 1). Поскольку измерение передачи энергии очень чувствительно к изменению расстояния, когда расстояния донор-акцептор близки к расстоянию Ферстера, приблизительные размеры целевого молекулярного взаимодействия являются наиболее важным фактором при выборе пары флуоресцентных красителей.Другие факторы, которые следует учитывать, в зависимости от того, проводятся ли измерения в установившемся режиме или с временным разрешением, включают химическую стабильность, квантовый выход и время жизни распада флуорофора. Поскольку для обычных методов флуоресцентного резонансного переноса энергии не существует внутреннего эталона расстояния, расстояния, вычисленные путем измерения эффективности переноса, относятся к расстоянию Ферстера, которое выводится из спектроскопических данных, измеренных на парах донор-акцептор.

Явление резонансной передачи энергии по механизму Ферстера сложно в некоторых аспектах, но простое и надежное по его результирующему эффекту.Расстояния Ферстера точно предсказываются из спектральных свойств донора и акцептора, и, поскольку никаких исключений из теории еще не выявлено, можно предположить, что резонансный перенос энергии происходит при любых условиях, при которых пара молекул донор-акцептор находится в непосредственной близости. Сложность в теории, описывающей перенос диполя, возникает не из-за самого механизма передачи, а из-за наличия распределений расстояний (включая неслучайные распределения) и диффузии молекул донора и акцептора.Когда предпринимаются шаги для усреднения зависимости передачи энергии от расстояния по диапазону геометрических форм и временных рамок, FRET представляет собой надежный метод изучения пространственного распределения между взаимодействующими молекулами.

Применение методов FRET в оптической микроскопии

Параметры конфигурации микроскопа для исследований флуоресцентного резонансного переноса энергии меняются в зависимости от требований к флуорофорам, образцу и режиму (режимам) визуализации, но практически любой вертикальный или инвертированный микроскоп можно модифицировать для микроскопии FRET (см. Рисунок 7).В общем, микроскоп должен быть оснащен охлаждаемой и усиленной системой CCD-камеры с высоким разрешением (12 бит), связанной с качественными интерференционными фильтрами, имеющими низкие уровни перекрестных помех (минимальный уровень блокировки) и полосы пропускания, соответствующие спектрам флуорофора. Чувствительность детектора определяет, насколько узкой может быть полоса пропускания фильтра, при этом сбор данных может продолжаться с приемлемой скоростью с минимумом сквозного спектрального шума. В большинстве случаев для получения изображений следует использовать одно дихроматическое зеркало, соединенное с колесами или ползунками фильтров возбуждения и излучения, чтобы минимизировать или устранить сдвиги изображения.

Широкопольная флуоресцентная микроскопия страдает от излучения флуорофора, возникающего выше и ниже фокальной плоскости, что дает изображения со значительным расфокусированным сигналом, который снижает контраст и приводит к ухудшению качества изображения. Эта проблема усугубляется в микроскопии FRET из-за изначально низких уровней сигнала, возникающих в результате резонансной передачи энергии. Методы цифровой деконволюции могут быть связаны с оптическим секционированием, чтобы уменьшить или исключить сигналы вдали от фокальной плоскости, но этот процесс требует больших вычислительных ресурсов и может быть недостаточно быстрым для многих экспериментов по динамической визуализации FRET.Конфокальные методы лазерного сканирования могут применяться к FRET-микроскопии для значительного улучшения латерального разрешения, позволяя собирать последовательные оптические срезы с интервалами, близкими к реальному времени. Основным недостатком конфокальной микроскопии является ограничение длин волн возбуждения стандартными лазерными линиями, доступными для конкретной системы, что ограничивает выбор пар флуорофора донора и акцептора в экспериментах по резонансному переносу энергии. Многофотонное возбуждение также может использоваться в сочетании с методами FRET и меньше повреждает клетки из-за задействованных более длинных волн возбуждения.Кроме того, артефакты автофлуоресценции и фотообесцвечивание образца с меньшей вероятностью возникают в пределах ограниченного объема возбуждения, характерного для многофотонного возбуждения.

Типичная конфигурация микроскопа, способная наблюдать живые клетки в культуре с несколькими мотивами изображения флуоресцентного резонансного переноса энергии, представлена ​​на Рисунке 7. Инвертированный микроскоп для культивирования тканей оснащен стандартной вольфрамово-галогенной лампой на столбе, чтобы исследовать и регистрировать ячейки, использующие стандартное светлое поле, фазовый контраст или дифференциальный интерференционный контраст ( DIC ) освещения.Обратите внимание, что последние два метода усиления контраста могут использоваться в сочетании с флуоресценцией, чтобы выявить пространственное расположение флуорофоров в клеточной архитектуре. Стандартная система CCD-камеры с охлаждением Пельтье прикреплена к тринокулярной головке микроскопа для получения широкоугольной флуоресценции и захвата изображений в светлом поле.

Эксперименты по резонансной передаче энергии проводятся с помощью мультиспектрального микроскопа, показанного на рисунке 7, с использованием либо широкопольного освещения (дуговая разрядная лампа), либо конфокальной сканирующей приставки в реальном времени, оснащенной высокоскоростной дисковой системой Нипкова.Луч аргонно-криптонового лазера сначала фильтруется через акустооптическое устройство с перестраиваемой длиной волны для выбора конкретных длин волн возбуждения перед прохождением к конфокальной сканирующей головке. Изображения собираются с помощью двух охлаждаемых ПЗС-камер высокого разрешения Gen III с усиленным охлаждением, считывающих отдельные каналы и загружаемых в главный компьютер. Сканирование образца в боковой ( x и y ) и осевой ( z ) плоскостях позволяет собирать оптические срезы для реконструкции трехмерного изображения.С проиллюстрированной конфигурацией микроскопа совместимы различные программы обработки изображений.

Основываясь на фундаментальных принципах явления, при проведении измерений флуоресцентного резонансного переноса энергии с помощью оптического микроскопа следует учитывать ряд важных практических моментов:

• Необходимо тщательно контролировать концентрации донорных и акцепторных флуорофоров. Статистически самая высокая вероятность достижения резонансного переноса энергии флуоресценции происходит, когда несколько акцепторных молекул окружают одну донорную молекулу.

• Фотообесцвечивание необходимо исключить, потому что артефакт может изменить молекулярное соотношение донора и акцептора и, следовательно, измеренное значение процесса резонансной передачи энергии.

• Спектр излучения донорной флуоресценции и спектр поглощения акцептора должны иметь значительную область перекрытия.

• Прямое возбуждение акцептора в диапазоне длин волн, используемом для возбуждения донора, должно быть минимальным.Распространенным источником ошибок в измерениях с помощью FRET-микроскопии в установившемся режиме является обнаружение донорной эмиссии с помощью наборов акцепторных фильтров.

• Длины волн излучения как донора, так и акцептора должны совпадать с максимальным диапазоном чувствительности детектора.

• Спектры поглощения и излучения донора должны иметь минимальное перекрытие, чтобы уменьшить возможность самопереноса от донора к донору.

• Донорная молекула должна быть флуоресцентной и иметь достаточно длительное время жизни, чтобы произошла резонансная передача энергии.

• Донор должен обладать низкой поляризационной анизотропией, чтобы минимизировать неопределенности в значении фактора ориентации ( k -квадрат). Этому требованию удовлетворяют доноры, излучение которых происходит в результате нескольких перекрывающихся переходов возбуждения.

• При использовании методов маркировки антител не следует изменять биологическую активность реагентов, конъюгированных с донорными и акцепторными флуорохромами. Любое снижение активности серьезно повлияет на достоверность результатов измерений резонансной передачи энергии.

• Поскольку резонансный перенос энергии флуоресценции требует, чтобы молекулы донора и акцептора имели соответствующее дипольное выравнивание и располагались в пределах 10 нанометров друг от друга, необходимо учитывать третичную структуру реагентов, к которым присоединены молекулы. Например, когда донорно-акцепторные молекулы могут быть прикреплены к различным структурным местоположениям (таким как карбокси или амино-конец) на белке, возможно, что FRET не будет наблюдаться, даже если белки действительно взаимодействуют, потому что донорные и акцепторные молекулы расположены на противоположных концах взаимодействующих молекул.

• Живые клетки, меченные зелеными флуоресцентными мутантами белка для исследований FRET, должны быть проанализированы с использованием традиционных иммуногистохимических методов, чтобы убедиться, что меченый белок принимает ту же внутриклеточную среду обитания и свойства, что и нативный аналог.

Для того, чтобы явление флуоресцентного резонансного переноса энергии предоставляло значимые данные в качестве инструмента в оптической микроскопии, необходимо оптимизировать как подготовку образцов, так и параметры визуализации.Выбор подходящих донорных и акцепторных зондов и способа их использования в качестве молекулярных меток является серьезной проблемой. Кроме того, как только стратегия маркировки, которая разрешает передачу энергии, была разъяснена, для выполнения самого измерения можно использовать широкий спектр методов. Большинство количественных исследований флуоресцентной микроскопии проводится путем измерения интенсивности флуоресцентного излучения. Детектирование FRET на основе интенсивности флуоресценции обычно достигается путем отслеживания изменений относительных величин интенсивности излучения на двух длинах волн, соответствующих донорному и акцепторному хромофорам.Когда условия подходят для возникновения резонансного переноса энергии флуоресценции, увеличение эмиссии акцептора ( I (A) ) сопровождается сопутствующим уменьшением интенсивности эмиссии донора ( I (D) ).

Хотя изменение относительной интенсивности излучения донора или акцептора можно считать показателем резонансного переноса энергии, обычный подход заключается в использовании отношения двух значений, I (A) / I (D) , как мера FRET.Величина отношения зависит от среднего расстояния между парами донор-акцептор и нечувствительна к различиям в длине пути и объёме, доступном для возбуждающего светового луча. Любое состояние образца, которое вызывает изменение относительного расстояния между молекулярными парами, вызывает изменение соотношения испускания донора и акцептора. Следовательно, FRET можно наблюдать в микроскопе путем преимущественного возбуждения донорного флуорофора и детектирования повышенного излучения взаимодействующего акцепторного флуорофора, сопровождаемого уменьшением флуоресценции донора, вызванным гашением из-за передачи энергии.Измерение FRET с использованием подхода мониторинга интенсивности называется стационарное изображение флуоресцентного резонансного переноса энергии.

Соответствующие донорные и акцепторные зонды выбираются на основе их спектральных характеристик поглощения и излучения. Для максимальной резонансной передачи энергии спектр излучения донора должен существенно перекрывать спектр поглощения акцептора. Кроме того, должно быть минимальное прямое возбуждение акцепторного флуорофора в максимуме возбуждения донора, и не должно быть значительного перекрытия эмиссии между донором и акцептором в области длин волн, в которой происходит эмиссия акцептора.На практике может быть сложно определить пары донор-акцептор, удовлетворяющие этим требованиям. Ситуация часто осложняется тем фактом, что имеющиеся в продаже наборы флуоресцентных фильтров не полностью эффективны при пропускании только желаемых длин волн, и может передаваться небольшой процент света за пределами проектной полосы пропускания. Если не используются очень хорошо охарактеризованные и контролируемые системы экспрессии, может быть трудно определить точную концентрацию донорных и акцепторных флуорофоров.Дополнительные корректировки могут также потребоваться для автофлуоресценции, фотообесцвечивания и фоновой флуоресценции.

Типичное исследование внутриклеточной белковой ассоциации в живой культуре клеток проиллюстрировано на рисунке 8 для событий, связанных с апоптозом, физическим процессом клеточной гибели, возникающим в результате сложного каскада последовательных взаимодействий. Генные продукты, непосредственно участвующие в цепи событий, могут быть помечены слиянием с соответствующими членами семейства флуоресцентных белков (в данном случае BFP и GFP) для совместной экспрессии в одной и той же клетке, чтобы исследовать специфические ассоциации с помощью FRET.Белки, участвующие в апоптозе, взаимодействуют внутри митохондрий и демонстрируют постепенное снижение связывания по мере того, как происходит запрограммированная гибель клеток. Таким образом, изображение эмиссии донора (рисунок 8 (a)) содержит только флуоресценцию от белков, меченных BFP, в то время как соответствующий профиль эмиссии акцептора (рисунок 9 (b)) иллюстрирует сигналы, обусловленные белками, меченными GFP (и некоторый вклад из донорская эмиссия). Фильтр FRET (рис. 8 (c)), как описано ниже, выявляет флуоресценцию, полученную в результате резонансной передачи энергии между двумя белками

Среди факторов, которые могут потенциально повлиять на точность измерений резонансного переноса энергии флуоресценции в целом, некоторые очень специфичны для оптического микроскопа.Основная цель микроскопических исследований — получить изображения с высоким разрешением, и это требует особого внимания к качеству и характеристикам оптических фильтров, используемых для спектрального различения длин волн поглощения и излучения донора и акцептора. Для максимального увеличения отношения сигнал / шум (без вредного воздействия на образец или исследуемый процесс) необходимо тщательно сбалансировать интенсивность и время воздействия возбуждающего света с концентрацией донорных и акцепторных флуорофоров и детектора. эффективность.Если концентрация донорно-акцепторных флуорофоров чрезмерна, может произойти самотушение, влияющее на точность измерений FRET. Фотообесцвечивание является проблемой всех флуорофоров и может повлиять на соотношение донор-акцептор, изменяя измерения флуоресценции. Избыточная интенсивность освещения также может повредить образцы, особенно содержащие живые клетки или ткани.

Метод, известный как донорский фотообесцвечивающий резонансный перенос энергии флуоресценции ( pbFRET ), который использует процесс фотообесцвечивания для измерения FRET, часто применяется при исследовании фиксированных образцов.Основанный на попиксельном анализе, этот метод был применен для измерения отношений близости между белками клеточной поверхности, меченными моноклональными антителами, конъюгированными с флуорофором. Фотообесцвечивание FRET основано на теории, согласно которой флуорофор чувствителен к фотоповреждению только тогда, когда он находится в возбужденном состоянии. Статистически только небольшая часть молекул находится в возбужденном состоянии в любой момент времени, и поэтому флуорофоры с более длительным временем жизни флуоресценции имеют более высокую вероятность фотоповреждения и демонстрируют более высокую скорость фотообесцвечивания.

Экспериментальные данные, подтверждающие эту концепцию, продемонстрировали, что время фотообесцвечивания флуорофора обратно пропорционально времени его жизни в возбужденном состоянии. Возникновение резонансного переноса энергии уменьшает время жизни флуоресценции молекулы донора, эффективно защищая ее от фотообесцвечивания. Расчеты pbFRET основаны на уменьшении скорости фотообесцвечивания донора по сравнению с измеренной для донора в отсутствие резонансной передачи энергии.Измерение фотообесцвечивания в исследованиях FRET требует относительно длительного периода времени и поэтому наиболее применимо к образцам фиксированных клеток, в которых временные данные не важны, а влияние фотообесцвечивания на функцию клеток не является проблемой. В некоторых отношениях метод фотообесцвечивания доноров менее сложен, чем измерение сенсибилизированного излучения, хотя подгонка постоянных времени к кривым фотообесцвечивания, включающим несколько компонентов, представляет некоторые дополнительные трудности.

Эффективность передачи энергии также может быть определена с помощью методов фотообесцвечивания акцептора , в которых изменение тушения испускания донора измеряется путем сравнения значения до и после селективного фотообесцвечивания молекулы акцептора.Анализ изменения интенсивности флуоресценции донора в одних и тех же областях образца до и после удаления акцептора имеет то преимущество, что требует подготовки только одного образца, и напрямую связывает эффективность передачи энергии с флуоресценцией как донора, так и акцептора.

Для точного измерения резонансного переноса энергии флуоресценции в микроскопе требуется компенсация всех потенциальных источников ошибок. Был разработан простой метод корректировки обнаружения донорной флуоресценции с помощью фильтра эмиссии акцептора и флуоресценции акцептора с фильтром эмиссии донора (из-за кроссовера или спектрального просвечивания).Метод также корректирует зависимость FRET от концентраций донорных и акцепторных флуорофоров. Стратегия измерения, которая требует минимум спектральной информации, использует комбинацию из трех наборов фильтров и может быть легко реализована. Наборы фильтров донора, FRET и акцептора предназначены для выделения и максимизации трех конкретных сигналов: флуоресценции донора, флуоресценции акцептора, относящейся к FRET, и флуоресценции непосредственно возбужденного акцептора, соответственно. На практике три разных образца, содержащие только донор, только акцептор, и донор, и акцептор, исследуются с каждым из трех наборов фильтров, а полученные данные обрабатываются арифметически для корректировки кроссовера и неконтролируемых изменений концентраций донор-акцептор.

На рисунке 9 представлены схематические иллюстрации кроссовера (спектрального просвечивания) и перекрестных помех фильтра, двух важных проблем, которые необходимо преодолеть, чтобы получить количественные результаты в экспериментах по флуоресцентной резонансной передаче энергии. Кроссовер или просачивание проявляется в перекрытии спектра излучения донорной флуоресценции с полосой пропускания интерференционного фильтра излучения акцептора на рисунке 9, в результате чего сигнал излучения донора (нежелательные длины волн) проходит через фильтр излучения.Напротив, перекрестные помехи фильтра описывают минимальный уровень затухания (блокировки) в определенном диапазоне двух фильтров, установленных вместе последовательно, и вызывают беспокойство при согласовании фильтров возбуждения и излучения для наборов флуоресценции. Дихроматические зеркала часто включают в оценку перекрестных помех комбинаций флуоресцентных фильтров. Хотя два эмиссионных фильтра редко устанавливаются на пути света одновременно, спектры объединены на рисунке 9, чтобы одновременно проиллюстрировать обе концепции.Обратите внимание, что два спектра фильтра (синяя и красная кривые) представляют собой коэффициент пропускания света интерференционными фильтрами, тогда как кривая излучения донора (зеленая) представляет собой график зависимости интенсивности от длины волны.

Дополнительные факторы, которые потенциально могут привести к значительным ошибкам, также требуют исправления при использовании методов измерения FRET в установившемся режиме. Кроме того, желателен тщательный контроль концентраций донорного и акцепторного флуорофора. Определения концентрации флуорофора можно частично избежать за счет применения измерений флуоресценции с временным разрешением, которые обеспечивают метод получения среднего времени жизни без точного знания концентраций доноров.Метод позволяет количественно определять расстояние разделения донор-акцептор и основан на измерениях времени жизни донора в присутствии и в отсутствие акцептора. Измерение затухания интенсивности флуоресценции как функции времени проясняет динамику излучения молекулы в возбужденном состоянии, и, следовательно, может быть получена более подробная информация о природе донорно-акцепторного взаимодействия. Графические графики спада интенсивности иллюстрируют усредненные по времени детали процесса затухания флуоресценции (см. Рисунок 10 (а)), которые не разрешаются при использовании методов устойчивого состояния.Измерения, показывающие одно и то же значение средней продолжительности жизни, когда они регистрируются как интенсивность в установившемся режиме, нормированная на поглощение, могут соответствовать существенно разным формам кривых затухания на графиках данных с временным разрешением, указывая на различия в участвующих межмолекулярных процессах.

Время жизни флуоресценции ( t ) флуорофора — это характерное время, в течение которого молекула находится в возбужденном состоянии перед возвращением в основное состояние. Представляя затухание флуоресценции в упрощенной единственной экспоненциальной форме после короткого импульса возбуждающего света, интенсивность флуоресценции как функция времени ( t ) определяется уравнением:

, где I (0) — начальная интенсивность излучения флуоресценции сразу после импульса возбуждающего света, а I (t) — это интенсивность флуоресценции, измеренная в момент времени t .Время жизни флуоресценции ( t ) определяется как время, необходимое для уменьшения интенсивности до 1 / e от ее начального значения (приблизительно 37 процентов от I (0) ; Рисунок 10 (a)), и составляет величина, обратная константе скорости затухания флуоресценции из возбужденного состояния в основное.

Основным общим преимуществом измерений FRET с временным разрешением по сравнению с установившимся режимом является то, что расстояние разделения донор-акцептор может быть нанесено на карту с большей количественной точностью.Это происходит отчасти потому, что время жизни флуоресценции не зависит от локальной интенсивности или концентрации и в значительной степени не зависит от фотообесцвечивания флуорофоров. Однако времена жизни флуоресценции очень чувствительны к среде флуорофора, и даже молекулы со сходными спектрами могут проявлять разные времена жизни в разных условиях окружающей среды. Поскольку рассеяние не влияет на время жизни флуорофора, измерения изменения времени жизни могут предоставить информацию, которая конкретно связана с локальными молекулярными процессами.

Срок службы флуорофора может быть изменен многочисленными переменными в локальном микроокружении, включая такие факторы, как гидрофобность, концентрация кислорода, ионная сила других компонентов среды, связывание с макромолекулами и близость к молекулам акцептора, которые могут истощить возбужденное состояние. резонансной передачей энергии. Значительным практическим преимуществом является то, что измерения времени жизни могут служить абсолютными индикаторами молекулярных взаимодействий и не зависят от концентрации флуорофора.

Два общих метода, обычно используемых для измерения времени жизни флуоресцентных ламп, классифицируются как во временной области ( импульсных , см. Рисунок 10 (а)) и в частотной области (также называемые с фазовым разрешением ; рисунок 10 (b) )) методы. При измерении срока службы во временной области используются источники света с импульсным возбуждением, а время жизни флуоресценции получается путем прямого измерения сигнала излучения или регистрации с помощью счета фотонов. Подход в частотной области использует синусоидальную модуляцию источника возбуждающего света (полученную от импульсных или модулированных лазерных систем), а время жизни определяется из фазового сдвига и глубины демодуляции сигнала флуоресцентного излучения.Каждый из этих подходов к визуализации времени жизни флуоресценции имеет определенные преимущества и недостатки, и оба широко применяются в традиционной широкопольной, конфокальной и многофотонной микроскопии.

На рисунке 10 показаны схематические диаграммы, представляющие методы временной и частотной областей для определения времени жизни флуоресценции. В подходе во временной области (рис. 10 (а)) образец возбуждается коротким импульсом лазерного света, длительность которого намного короче, чем время жизни возбужденных частиц, и измеряется экспоненциальный профиль затухания как функция времени.Затухание флуоресценции обычно является моноэкспоненциальной функцией для одного флуорофора, но может иметь гораздо более сложный характер, если возбужденное состояние имеет многочисленные пути релаксации, доступные в окружающей среде. Синусоидально модулированный свет от лазера непрерывного действия, соединенного с акустооптическим модулятором, используется для возбуждения флуорофора в экспериментах в частотной области (рис. 10 (b)). Результирующее флуоресцентное излучение модулируется синусоидально на той же частоте, что и возбуждение, но сопровождается фазовым сдвигом и уменьшением глубины модуляции.В случае однократного экспоненциального затухания время жизни флуоресценции можно рассчитать, определив либо степень фазового сдвига ( f ), либо коэффициент модуляции ( M ), используя уравнения, представленные на рисунке 10 (b). Если два значения идентичны, затухание флуоресценции действительно состоит из одной экспоненциальной функции. Когда присутствует более одного флуоресцентного вещества (или один флуорофор находится в сложной среде), фазовый сдвиг и время жизни модуляции следует оценивать в широком диапазоне частот.

Метод измерения времени жизни флуоресценции во временной области в основном основан на подсчете одиночных фотонов и требует системы детектирования с достаточным временным разрешением для сбора почти 100 процентов фотонов, генерируемых каждым импульсом возбуждения. Хотя методы с фазовым разрешением относительно менее требовательны к выполнению, они, как правило, не так чувствительны, как метод подсчета фотонов. Когда фазовая модуляция используется для разрешения сложных времен жизни мультифлуорофоров, длительное время воздействия повреждающего возбуждающего света может оказаться чрезмерным для некоторых образцов, а также может не обеспечить достаточного временного разрешения для процессов с живыми клетками.Предпочтительный метод зависит как от информации, необходимой для исследования, так и от типа исследуемого образца.

Измерения времени жизни флуоресценции оказались чувствительным индикатором FRET и имеют особые преимущества при исследованиях живых клеток из-за независимости измерений времени жизни от таких факторов, как концентрация и длина светового пути, которые трудно контролировать в живых образцах. Основное преимущество выполнения FRET-исследований с помощью измерения времени жизни флуоресценции заключается в том, что можно различать перенос энергии даже между донорно-акцепторными парами с аналогичными спектрами излучения.Когда время жизни флуоресценции измеряется напрямую (в отличие от использования значений в установившемся состоянии), определение FRET возможно без фотодеструкции донорных или акцепторных флуорофоров. Поскольку FRET уменьшает время жизни флуоресценции донорной молекулы за счет передачи энергии акцептору, прямое сравнение времени жизни донора в присутствии акцептора ( t (DA) ) с временем жизни в отсутствие акцептора ( t ( D) ), позволяет вычислять значение эффективности FRET ( E (T) ) для каждого пикселя изображения.

В зависимости от метода измерения времени жизни флуоресценции требуют, чтобы образец подвергался воздействию либо высокочастотных повторяющихся импульсов возбуждающего света, либо непрерывного синусоидально модулированного света. В исследованиях с живыми клетками всегда необходимо оценивать эффект интенсивного освещения. Независимо от метода, эталонное время жизни донора без акцептора должно быть определено в экспериментальных условиях, идентичных условиям измерения донор-акцептор.Одним из способов достижения этого с одним образцом является измерение времени жизни только донора после фотообесцвечивания акцептора после эксперимента по передаче энергии.

Выводы

В биологических исследованиях наиболее распространенными применениями резонансного переноса энергии флуоресценции являются измерение расстояний между двумя участками макромолекулы (обычно белка или нуклеиновой кислоты) или исследование взаимодействия in vivo между биомолекулярными объектами.Белки могут быть помечены синтетическими флуорохромами или иммунофлуоресцентными флуорофорами, которые служат донором и акцептором, но достижения в генетике флуоресцентных белков теперь позволяют исследователям маркировать определенные целевые белки множеством биологических флуорофоров, имеющих разные спектральные характеристики. Во многих случаях аминокислота триптофан используется в качестве флуорофора внутреннего донора, который может быть связан с любым количеством внешних зондов, выступающих в качестве акцептора.

Если макромолекулы помечены одним донором и акцептором, а расстояние между двумя флуорохромами не изменяется в течение времени жизни возбужденного состояния донора, то расстояние между зондами можно определить по эффективности передачи энергии посредством измерений в установившемся режиме, как обсуждалось выше.В случаях, когда расстояние между донором и акцептором колеблется вокруг кривой распределения, например, белковые сборки, мембраны, одноцепочечные нуклеиновые кислоты или развернутые белки (см. Сценарии, представленные на рисунке 11), FRET все еще можно использовать для изучения явления, но предпочтительны измерения срока службы с временным разрешением. Несколько биологических приложений, которые попадают в оба случая, показаны на рисунке 11, включая конформационные изменения, диссоциацию или гидролиз, слияние мембраноподобных липидных везикул и взаимодействия лиганд-рецептор.

Несмотря на то, что для измерения резонансного переноса энергии флуоресценции в оптическом микроскопе доступны различные методы, ни один из них не лишен недостатков. Некоторые методы требуют более сложных и дорогих инструментов, в то время как другие основаны на предположениях, которые необходимо тщательно проверять. Некоторые подходы подходят для фиксированных образцов, но не могут применяться к системам живых клеток, в то время как другие методы должны включать значительные корректирующие вычисления или алгоритмы анализа данных.Тем не менее, несомненно, что анализ FRET показывает большие перспективы для дальнейшего развития полезности и объема биологических приложений. В последние годы произошли драматические улучшения в инструментарии, особенно в отношении методов с временным разрешением.

Измерения времени жизни флуоресценции, которые раньше выполнялись крайне сложно, теперь поддерживаются зрелыми пикосекундными и наносекундными технологиями. Успехи в разработке флуоресцентных зондов позволили получить более мелкие и более стабильные молекулы с новыми механизмами прикрепления к биологическим мишеням.Были также разработаны флуорофоры с широким диапазоном времени жизни в собственном возбужденном состоянии, и значительные усилия прилагаются к развитию большего разнообразия генетических вариаций флуоресцентных белков. Совершенно новые классы флуоресцентных материалов, многие из которых меньше, чем предыдущие флуорофоры, и позволяют оценивать молекулярные взаимодействия на более низких расстояниях разделения, обещают улучшить универсальность мечения и привести к новым применениям метода FRET.

Соавторы

Брайан Херман и Виктория Э.Centonze Frohlich — Департамент клеточной и структурной биологии, Научный центр здравоохранения Техасского университета, 7703 Floyd Curl Drive, Сан-Антонио, Техас 78229.

Джозеф Р. Лакович — Центр флуоресцентной спектроскопии, Департамент биохимии и молекулярной биологии, Университет штата Мэриленд и Институт биотехнологии Университета Мэриленда (UMBI), 725 West Lombard Street, Baltimore, Maryland 21201.

Thomas J. Fellers и Michael W.Дэвидсон — Национальная лаборатория сильного магнитного поля, 1800 г. Ист. Пол Дирак, доктор философии, Университет штата Флорида, Таллахасси, Флорида, 32310.

НАЗАД К ФЛУОРЕСЦЕНТНОЙ МИКРОСКОПИИ

Вопросы или комментарии? Отправить нам письмо.

© 1998-2019, автор — Майкл В. Дэвидсон и Государственный университет Флориды. Все права защищены. Никакие изображения, графика, сценарии или апплеты не могут быть воспроизведены или использованы каким-либо образом без разрешения владельцев авторских прав.Использование этого веб-сайта означает, что вы соглашаетесь со всеми юридическими положениями и условиями, изложенными владельцами.

Этот веб-сайт поддерживается нашей командой
по графике и веб-программированию
в сотрудничестве с оптической микроскопией в Национальной лаборатории сильного магнитного поля
.

Последнее изменение: пятница, 13 ноября 2015 г., 13:19

Счетчик доступа с 26 ноября 2004 г .: 81535

Для получения дополнительной информации о производителях микроскопов,
используйте кнопки ниже для перехода на их веб-сайты:

Дифференциальные уравнения — основные понятия

Примечания Быстрая навигация Скачать

• Перейти к
• Примечания
• Задачи практики и задания еще не написаны.Пока позволяет время, я работаю над ними, однако у меня нет того количества свободного времени, которое я имел раньше, поэтому пройдет некоторое время, прежде чем здесь что-нибудь появится.
• Показать / Скрыть
• Показать все решения / шаги / и т. Д.
• Скрыть все решения / шаги / и т. Д.

• Разделы
• Введение в DE второго порядка
• Настоящие и отчетливые корни
• Главы
• Первый заказ DE
• Преобразование Лапласа
• Классы
• Алгебра
• Исчисление I
• Исчисление II
• Исчисление III
• Дифференциальные уравнения
• Дополнительно
• Алгебра и триггерный обзор
• Распространенные математические ошибки
• Праймер для комплексных чисел
• Как изучать математику

концепция соответствует — (Разработчик) — AppAgg

Преобразование сантиметров в футы — Преобразование единиц измерения

›› Перевести сантиметры в футы

Пожалуйста, включите Javascript использовать конвертер величин

›› Дополнительная информация в конвертере величин

Сколько см в 1 футе? Ответ — 30.48.
Предполагается, что вы переводите сантиметров в футов .
Вы можете просмотреть более подробную информацию о каждой единице измерения:
см или футов
Базовая единица СИ для длины — метр.
1 метр равен 100 см или 3,2808398950131 футам.
Обратите внимание, что могут возникать ошибки округления, поэтому всегда проверяйте результаты.
Используйте эту страницу, чтобы узнать, как преобразовать сантиметры в футы.
Введите свои числа в форму, чтобы преобразовать единицы!

›› Таблица преобразования сантиметров в фут

1 см в фут = 0.03281 фут

10 см в футы = 0,32808 футов

20 см в футы = 0,65617 футов

30 см в футы = 0,98425 футов

40 см в футы = 1,31234 фута

50 сантиметров в фут = 1,64042 фута

100 см в фут = 3,28084 фута

200 футов в фут = 6,56168 футов

›› Хотите другие единицы?

Вы можете произвести обратное преобразование единиц измерения из футы в сантиметры или введите любые две единицы ниже:

›› Обычные преобразования длины

см до поселка
см до вершка
см до локтя
см до четверти
см до пирога
см до дира
см до милхи
см до прямой стопы
см до скобы
см до проушины

›› Определение: сантиметр

Сантиметр (сантиметр в американском написании, символ см) — это единица измерения длины, равная одной сотой метра, текущей базовой единице длины в системе СИ.Сантиметр — это часть метрической системы. Это базовая единица в системе единиц сантиметр-грамм-секунда. Соответствующая единица площади — квадратный сантиметр. Соответствующая единица объема — кубический сантиметр.

Сантиметр в настоящее время является нестандартным коэффициентом, поэтому часто предпочтительны коэффициенты 10 ³ . Однако это практичная единица измерения длины для многих повседневных измерений. Сантиметр — это примерно ширина ногтя взрослого человека.

›› Определение: Foot

Фут (множественное число: фут) — внесистемная единица измерения расстояния или длины, составляющая около трети метра.В одном футе двенадцать дюймов, а в ярде — три фута.

›› Метрические преобразования и др.

ConvertUnits.com предоставляет онлайн калькулятор преобразования для всех типов единиц измерения. Вы также можете найти метрические таблицы преобразования для единиц СИ. в виде английских единиц, валюты и других данных. Введите единицу символы, сокращения или полные названия единиц длины, площадь, масса, давление и другие типы. Примеры включают мм, дюйм, 100 кг, жидкая унция США, 6 футов 3 дюйма, 10 стоун 4, кубический см, метры в квадрате, граммы, моль, футы в секунду и многое другое!

Экзамен CFA Level I на 2020 год: итоги обучения

• A: корреляция = 1. Это указывает на идеальную линейную связь между двумя активами. Диверсификация не имеет потенциальных преимуществ.
• B: корреляция = 0,5. Диверсификация портфеля может быть достигнута. Чем ниже корреляция, тем больше выгода от диверсификации.
• C: корреляция = 0.Это указывает на отсутствие линейной зависимости между двумя активами. Возможна большая диверсификация, чем у B.
• D: корреляция = -1. Это указывает на идеальную обратную линейную зависимость. Обратите внимание, что граница минимальной дисперсии имеет два линейных сегмента: XZ и ZY. XZ (линия D) — эффективная граница. При желании риск портфеля можно свести к нулю.

• Первый компонент становится очень маленьким.
• Второй компонент приближается к Cov-bar.

• Для достижения 90% диверсификации требуется менее 30 акций.
• Чем выше средняя корреляция, тем большее количество запасов необходимо для достижения указанного снижения риска.
• Если вы добавите больше акций в портфель, стандартное отклонение портфеля в конечном итоге достигнет уровня рыночного портфеля.

Практический вопрос 1

А. -1.
B. 0.
C. 1.
D. — бесконечность.

Корреляция — это число от -1 до +1.Чем ниже корреляция, тем больше выгода от диверсификации.

Практический вопрос 2

A. Индивидуальные риски активов.
B. Средняя дисперсия индивидуальных активов.
C. Средняя ковариация.
D. Рыночный риск.

Дисперсия портфеля приближается к средней ковариации по мере увеличения количества активов.

Практический вопрос 3

Практический вопрос 4

A. имеет доходность, которая отрицательно коррелирует с другими акциями в портфеле.
Б. из отрасли, которая еще не представлена ​​в портфеле.
C. имеет доходность, которая положительно коррелирует с крупнейшими активами в этом портфеле.

5 Теория портфеля

А.выявление бессистемного риска.
Б. Устранение систематического риска.
C. влияние диверсификации на портфельный риск.

Практический вопрос 6

А.И портфель X, и портфель Y плохо диверсифицированы.
Б. Портфель X хорошо диверсифицирован, а портфель Y плохо диверсифицирован.
C. Портфель X слабо диверсифицирован, а портфель Y хорошо диверсифицирован.

Практический вопрос 7

A. Еще больше откажитесь, покупая Black.
Б. больше снижать, покупая зеленый.
C. Увеличьте, покупая либо черный, либо зеленый.

А. +1.0.
Б. 0.0.
С. -1,0.

Практический вопрос 9

Я.Чем выше средняя корреляция, тем меньше запасов нам нужно для достижения целевого снижения риска.
II. Дисперсия равновзвешенного портфеля приближается к средней дисперсии, когда n становится большим.

I: Чем ниже корреляция, тем больше выгода от диверсификации.
II: Это приближается к средней ковариации.

Практический вопрос 10

При прочих равных условиях портфель с наименьшей или наиболее отрицательной корреляцией будет иметь наименьший риск.