Posted in: Разное

Лада гранта разгон до 100: Обновленная Лада Гранта — тест-драйв — журнал За рулем

Содержание

ВАЗ Granta Седан — разгон до 100 км/ч

UP-100.RU

Разгон до 100км/ч


всех авто мира

Разгон от 0 до 100 км/ч автомобиля ВАЗ Granta Седан в секундах.

В таблице перечислены все возможные конфигурации данной модели и указаны базовые характеристики двигателя: объем, максимальная мощность, максимальный крутящий момент и максимальная скорость.

Реальная скорость разгона обычно немного ниже, чем в данных, предоставленных производителем, вследствие многих факторов, таких как, например, нештатный размер колес и дисков, износ двигателя и трансмиссии, степень загрузки автомобиля, дорожные условия. Также необходимо учитывать, что показания спидометра выше реальной скорости. На 100км/ч погрешность составляет порядка 3-10км/ч.

Модификации (5)

Модель Конфигурация Макс. скорость Разгон 0-100 км/ч
ВАЗ Granta Седан 1.6 MT (106 л.с.), 148 Н*м /4000 об.
(2013 — )
177 км/ч
11.0 сек.
ВАЗ Granta Седан 1.6 MT (87 л.с.), 140 Н*м /3800 об.
(2011 — )
167 км/ч 11.8 сек.
ВАЗ Granta Седан 1.6 AT (98 л.с.), 145 Н*м /4000 об.
(2012 — )
170 км/ч 12.0 сек.
ВАЗ Granta Седан 1.6 MT (98 л.с.), 145 Н*м /4000 об.
(2011 — )
175 км/ч 12.0 сек.
ВАЗ Granta Седан 1.6 MT (82 л.с.), 132 Н*м /3500 об.
(2011 — )
164 км/ч 12.5 сек.

Сравнить с другими авто

Кто быстрее (15237) МаркаACAcuraAlfa RomeoAlpineAM GeneralArielAroAsiaAston MartinAudiAustinAutobianchiBaltijas DzipsBeijingBentleyBertoneBitterBMWBMW AlpinaBrabusBrillianceBristolBuforiBugattiBuickBYDByvinCadillacCallawayCarbodiesCaterhamChanganChangFengCheryChevroletChryslerCitroenCizetaCoggiolaDaciaDadiDaewooDAFDaihatsuDaimlerDallasDatsunDe TomasoDeLoreanDerwaysDodgeDongFengDoninvestDonkervoortE-CarEagleEagle CarsEcomotorsFAWFerrariFiatFiskerFordFotonFSOFuqiGeelyGeoGMCGonowGreat WallHafeiHaimaHindustanHoldenHondaHuangHaiHummerHyundaiInfinitiInnocentiInvictaIran KhodroIsderaIsuzuIVECOJACJaguarJeepJensenJMCKiaKoenigseggKTMLamborghiniLanciaLand RoverLandwindLexusLiebao MotorLifanLincolnLotusLTILuxgenMahindraMarcosMarlinMarussiaMarutiMaseratiMaybachMazdaMcLarenMegaMercedes-BenzMercuryMetrocabMGMicrocarMinelliMiniMitsubishiMitsuokaMorganMorrisNissanNobleOldsmobileOpelOscaPaganiPanozPeroduaPeugeotPiaggioPlymouthPontiacPorschePremierProtonPUCHPumaQorosQvaleReliantRenaultRenault SamsungRolls-RoyceRonartRoverSaabSaleenSantanaSaturnScionSEATShuangHuanSkodaSmartSoueastSpectreSpykerSsang YongSubaruSuzukiTalbotTATATatraTazzariTeslaTianmaTianyeTofasToyotaTrabantTramontanaTriumphTVRVauxhallVectorVenturiVolkswagenVolvoVortexWartburgWestfieldWiesmannXin KaiZastavaZotyeZXЁ-мобильАвтокамАстроБронтоВАЗГАЗЗАЗЗИЛИЖКамАЗМосквичСМЗСеАЗТагАЗУАЗUltimaHawtaiRenaissanceМодельКто медленнее (8475)

VAZ разгон до 100

   Технические характеристики.  ВАЗ Гранта Приора Lada sport
   ВАЗ 2101
разгон разгон до 100
квотер 1/4мили
объем/мощн л.с
макс.скор
 
 1970 ВАЗ 2101  20 с разгон до 100  20.5  1.2л/64  140
 1974 ВАЗ 21011  18 с разгон до 100  19.9  1.3л/70  145
 1978 ВАЗ 21013  20 с разгон до 100  20.5  1.2л/64  142
 
   ВАЗ 2102
разгон разгон до 100
квотер 1/4мили
объем/мощн л.с
макс.скор
 
 1971 ВАЗ 2102  23 с разгон до 100  20.9  1.2л/64  137
 1971 ВАЗ 21021  20 с разгон до 100  20.3  1.3л/70  145
 
   ВАЗ 2103
разгон разгон до 100
квотер 1/4мили
объем/мощн л.с
макс.скор
 
 1972 ВАЗ 2103  19 с разгон до 100  19.8
 1.5л/72
 150
 1977 ВАЗ 21033  21 с разгон до 100  20.0  1.3л/70  143
 1972 ВАЗ 21035  23 с разгон до 100  20.6  1.2л/64  140
 
   ВАЗ 2104
разгон разгон до 100
квотер 1/4мили
объем/мощн л.с
макс.скор
 
  1984 ВАЗ 2104  23 с разгон до 100
 21.6
 1.2л/58  137
  1984 ВАЗ 21041  23 с разгон до 100  21.5  1.2л/59  137
  1984 ВАЗ 21043  17 с разгон до 100  20.4  1.5л/70  143
  1997 ВАЗ 21044  17 с разгон до 100  19.6  1.7л/79  140
  1984 ВАЗ 21045  23 с разгон до 100  22.6  1.3л/50  125
 
   ВАЗ 2105
разгон разгон до 100
квотер 1/4мили
объем/мощн л.с
макс.скор
 
 1980 ВАЗ 2105  18 с разгон до 100  20.8  1.3л/64  145
 1980 ВАЗ 21051  20 с разгон до 100  21.3  1.2л/59  142
 1980 ВАЗ 21053  17 с разгон до 100
 20.1
 1.5л/71  150
 1980 ВАЗ 21055  23 с разгон до 100  22.4  1.5л/50  125
  ВАЗ 2105 Lotus  7.1 с разгон до 100  15.5  168л.с.  228
 
   ВАЗ 2106
разгон разгон до 100
квотер 1/4мили
объем/мощн л.с
макс.скор
 
 1976 ВАЗ 2106
 16 с разгон до 100  20.0  1.6л/75   152
 1979 ВАЗ 21061  17 с разгон до 100  20.4  1.5л/71  150
 1982 ВАЗ 21063  19 с разгон до 100  21.0  1.3л/64  145
 1990 ВАЗ 21065  17 с разгон до 100  20.4  1.5л/71  150
 
   ВАЗ 2107
разгон разгон до 100
квотер 1/4мили
объем/мощн л.с
макс.скор
 
 1982 ВАЗ 2107  17 с разгон до 100  20.3  1.5л/71  150
 1982 ВАЗ 21072  18 с разгон до 100  21  1.3л/64  145
 1982 ВАЗ 21073  17 с разгон до 100  19.9  1.7л/76  155
 1982 ВАЗ 21074  16 с разгон до 100  20  1.6л/75  150
 1982 ВАЗ 21075  25 с разгон до 100  20.9  1.5л/65  127
 1982 ВАЗ 21079  9 с разгон до 100  16.5  1.3л/140  180
 
   ВАЗ 2108 Lada samara
разгон разгон до 100
квотер 1/4мили
объем/мощн л.с
макс.скор
 
 1984 ВАЗ 2108 Lada samara
 16 с разгон до 100  19.3  1.3л/63   148
 1984 ВАЗ 21081 Lada samara  17 с разгон до 100  20.4  1.1л/54  139
 1984 ВАЗ 21083 Lada samara  14 с разгон до 100  18.9  1.5л/68  154
 1984 ВАЗ 21083-91 Lada samara  8 с разгон до 100  15.7  1.3л/140  200
 
   ВАЗ 2109 Lada samara
разгон разгон до 100
квотер 1/4мили
объем/мощн л.с
макс.скор
 
 1987 ВАЗ 2109 Lada samara  16 с разгон до 100  19.7  1.3л/64  148
 1987 ВАЗ 21091 Lada samara  17 с разгон до 100  20.8  1.1л/54  139
 1990 ВАЗ 21093 Lada samara  14 с разгон до 100  19.6  1.5л/68  154
 1990 ВАЗ 21099 Lada samara  14 с разгон до 100  19.6  1.5л/68  154
 
   ВАЗ 2110
разгон разгон до 100
квотер 1/4мили
объем/мощн л.с
макс.скор
 
 1996 ВАЗ 2110  14 с разгон до 100  19.2  1.5л/71   165
 1996 ВАЗ 21101  13.5 с разгон до 100  18.5  1.6л/80  170
 1996 ВАЗ 21102  14 с разгон до 100  18.6  1.5л/79  167
 1996 ВАЗ 21103  12.5 с разгон до 100  18.3  1.5л/92  185
 2000 ВАЗ 21104  12 с разгон до 100  17.9  1.6л/89  180
 1996 ВАЗ 21106  9.5 с разгон до 100  15.7  2.0л/148  205
 1999 ВАЗ 21108  13 с разгон до 100  17.9  1.5л/91  170
 
   ВАЗ 2111
разгон разгон до 100
квотер 1/4мили
объем/мощн л.с
макс.скор
 
 2000 ВАЗ 2111  14 с разгон до 100  18.9  1.5л/78  162
 1997 ВАЗ 21110  15 с разгон до 100  19  1.5л/76  160
 1998 ВАЗ 21111  14 с разгон до 100  19.5  1.5л/71  162
 1998 ВАЗ 21112  14 с разгон до 100  18.7  1.6л/80  165
 1997 ВАЗ 21113  12.5 с разгон до 100  17.8  1.5л/94  175
 2001 ВАЗ 21114  13 с разгон до 100  18  1.6л/89  175
 
   ВАЗ 2112
разгон разгон до 100
квотер 1/4мили
объем/мощн л.с
макс.скор
 
 2001 ВАЗ 2112  12 с разгон до 100  18  1.6л/89  180
 2000 ВАЗ 21121  13.5 с разгон до 100  18.7  1.6л/80  170
 2000 ВАЗ 21122  14 с разгон до 100  18.8  1.5л/78  167
 2006 ВАЗ 21123-купе  13 с разгон до 100  17.9  1.6л/92  180
 2001 ВАЗ 21124  12 с разгон до 100  17.7  1.6л/91  185
 
   ВАЗ Lada samara2
разгон разгон до 100
квотер 1/4мили
объем/мощн л.с
макс.скор
 
 2004 ВАЗ 21130 Lada samara2  13.2 с разгон до 100  18.3  1.5л/79  158
 2004 ВАЗ 21134 Lada samara2  12.3 с разгон до 100  18.2  1.6л/81  162
 2001 ВАЗ 21140 Lada samara2  14 с разгон до 100  18.3  1.5л/79  157
 2007 ВАЗ 21144 Lada samara2  13 с разгон до 100  18.2  1.6л/81  160
 1997 ВАЗ 21150 Lada samara2  13 с разгон до 100  18.3  1.5л/79  155
 2003 ВАЗ 21154 Lada samara2  13.2 с разгон до 100  18.4  1.6л/81  158
 2000 ВАЗ 2115-91 Lada samara2  9 с разгон до 100  15.8  1.3л/140  205 
 
   ВАЗ Lada Kalina
разгон разгон до 100
квотер 1/4мили
объем/мощн л.с
макс.скор
 
 2007 ВАЗ 1117 Lada Kalina  12.9 с разгон до 100  18.5  1.6л/86  170
 2007 ВАЗ 11173 Lada Kalina 8v  13.2 с разгон до 100  18.8  1.6л/81  163
 2007 ВАЗ 11174 Lada Kalina 16v  12.5 с разгон до 100  17.9  1.6л/98  185
 2004 ВАЗ 11183 Lada Kalina  13.2 с разгон до 100  18.8  1.6л/81  160
 2004 ВАЗ 11184 Lada Kalina  12.9 с разгон до 100  18.5  1.4л/89  165
 2006 ВАЗ 1119 Lada Kalina  12.9 с разгон до 100  18.9  1.4л/80  165
 
   ВАЗ Lada Priopa
разгон разгон до 100
квотер 1/4мили
объем/мощн л.с
макс.скор
 
 2007 ВАЗ 2170 Lada Priopa  11.3 с разгон до 100  17.5  1.6л/98  183
 2009 ВАЗ 21713 Lada Priopa  11.3 с разгон до 100  17.5  1.6л/98  183
 
   ВАЗ Granta
разгон разгон до 100
квотер 1/4мили
объем/мощн л.с
макс.скор
 
 2011 ВАЗ 2190 Granta  12.5 с разгон до 100  18.5  1.6л/82  164
 2011 ВАЗ 2191 Granta  11.8 с разгон до 100  18.1  1.6л/87  167
 2011 ВАЗ Granta Sport  5.6 с разгон до 100  13.6  1.6л/235  более 230км/ч
 
   ВАЗ ОКА
разгон разгон до 100
квотер 1/4мили
объем/мощн л.с
макс.скор
 
 1989 ВАЗ 1111 ОКА  30 с разгон до 100  23.8  0.7л/30  120
 1996 ВАЗ 11113 ОКА  24 с разгон до 100  22.5  0.8л/35  130
 
   ВАЗ Lada NIVA
разгон разгон до 100
квотер 1/4мили
объем/мощн л.с
макс.скор
 
 1978 ВАЗ 2121 Lada NIVA  23 с разгон до 100  20.7   1.6л/75  132
 1994 ВАЗ 21213 Lada NIVA  19 с разгон до 100  20.6  1.7л/76  137
 2001 ВАЗ 21214 Lada NIVA  19 с разгон до 100  20.3  1.7л/80  142
 1993 ВАЗ 21215 Lada NIVA  25 с разгон до 100  21.7  1.9л/64  127
 1994 ВАЗ 21219Lada NIVA  19 с разгон до 100  20.6  1.7л/76  137
 1998 ВАЗ 2123 Lada NIVA  17 с разгон до 100  20.2  1.7л/80  150
 
   ВАЗ Прототип
разгон разгон до 100
квотер 1/4мили
объем/мощн л.с
макс.скор
 
 2004 Lada Revolution  6.5 с разгон до 100  13.8  1.6л/215  240
 2008 Lada Revolution3  5.9 с разгон до 100  13.2  2.0л/245  260
 
 
   Лада Ларгус
разгон разгон до 100
квотер 1/4мили
объем/мощн л.с
макс.скор
 
 2012 Лада Ларгус R90 7 мест 16кл  13.5 с разгон до 100    1.6/105  165
 2012 Лада Ларгус R90 7 мест 8кл   15.4 с разгон до 100    1.6/87  155
 2012 Лада Ларгус R90 5 мест 16кл  13.1 с разгон до 100    1.6/105  165
 2012 Лада Ларгус R90 5 мест 8кл   14.5 с разгон до 100    1.6/87  156
 2012 Лада Ларгус F90 Фургон 16кл  14.0 с разгон до 100    1.6/105  165
 2012 Лада Ларгус F90 Фургон 7 8кл   15.9 с разгон до 100    1.6/87  155
 

  Очень интересное и познавательное, в авто мире:

Спортивные зимние шины
Таблица разгона до 200 и 300
Все о системах двигателя 
Как выиграть в драг гонке
Все о суперкаре Lexsus LFA

Технические характеристики Lada Granta Sport 2021 в новом кузове

Общая информация

Класс автомобиля

Количество дверей

Количество мест

Тип двигателя

Колёсная база

Ширина задней колеи

Ширина передней колеи

Объем багажника мин/макс, л

Объём топливного бака, л

Полная масса, кг

Снаряженная масса, кг

Количество передач

Коробка передач

Подвеска и тормоза

Задние тормоза

Передние тормоза

Тип задней подвески

Тип передней подвески

Эксплуатационные показатели

Максимальная скорость, км/ч

Марка топлива

Разгон до 100 км/ч, с

Расход топлива, л город

Расход топлива, л город/смешанный

Расход топлива, л город/трасса/смешанный

Расход топлива, л смешанный

Диаметр цилиндра и ход поршня, мм

Количество цилиндров

Максимальная мощность, л.с./кВт при об/мин

Максимальный крутящий момент, Н*м при об/мин

Объем двигателя, см³

Расположение двигателя

Расположение цилиндров

Степень сжатия

Тип двигателя

Название рейтинга

Оценка безопасности

Аккумуляторная батарея

Запас хода на электричестве, км

как «Нива» разгоняется до сотни за 2 секунды — Российская газета

Заголовок с феноменальными цифрами — не кликбейт. Если мы и слукавили, то на какие-то 3 десятые секунды, потому что настоящее время разгона этого автомобиля до 100 км/ч — 2,3 секунды. А за 6 секунд этот внедорожник сможет развить скорость в 200 км/ч.

Впрочем, это, конечно, не обычная «Нива». Над ней основательно поработали украинские тюнеры и специалисты польской фирмы VTG — и называется машина Lada Niva LSx Turbo 4×4. Внешне — почти ничего необычного. Слегка скорректирован передок за счет решетки радиатора, навешены другие зеркала, смонтированы иные колесные арки, поскольку немного выросла колея. Но главные изменения произошли по части силовой установки.

Под капотом этой «Нивы» удалось разместить настоящий V8 объемом 6,4 литра от Chevrolet Corvette. Только сам спорткар с таким мотором ездит медленнее — потому что агрегат существенно доработали и оснастили турбиной Precision. В итоге уже в «базе» — то есть начальной конфигурации — двигатель способен выдать 1250 л.с., а если его еще «раскачать» — то и все 2500 «лошадей». Такой табун, понятно, сделает реактивной любую машину.

У «Нивы», штатный двигатель которой расчитан на 83 л.с., понятно, пришлось переделать и ходовую. Передний мост взяли от того же Chevrolet, задний — от пикапа Ford, рулевой механизм — у BMW. Ну и салон машины теперь под стать мотору — зачетно оспортивлен. О наличии силового каркаса не стоит и говорить.

Ну а то, что кто-то из читателей до сих пор не верит в способность «Нивы» обогнать на короткой прямой 1200-сильный Porsche 9FF или зяряженные Subaru Impreza WRX и Audi RS6 — не беда. Потому что их водители (читай — пилоты) тоже не верили до самого финиша. И не исключено, что до сих пор время от времени пересматривают это видео, чтобы понять, как же это чудо произошло.

Приора разгон до 100 время – АвтоТоп

Прошло уже 2 года с прошлого видео о замере разгона 0-100, тогда получилось 9.5, переключался на 5500. За это время в машине кое-что изменилось: Полная шумоизоляция, было установлено ГБО, была прошита под евро 2 и отсечку сдвинули на 6800. Прошили не для того что бы «валила» от этого в динамике не изменилось ровным счетом ничего, делал это для того чтобы не вылез чек после удаления катализатора, который кстати еще не убран😄, хотя прошивку сделал в прошлом году.
Вообщем мне стало интересно на сколько увеличился разгон спустя время. При условии что переключался на 6500 получилось те же 9.5 из этого делаем вывод что вес дает о себе знать, к сожалению я не сделал точное видео с переключением на 5500, было бы наглядно видно разницу.


Пробег: 100310 км

Лада Приора Хэтчбек 2012, двигатель бензиновый 1.6 л., 98 л. с., передний привод, механическая коробка передач — покатушки

Машины в продаже

Лада Приора, 2011

Лада Приора, 2011

Лада Приора, 2011

Лада Приора, 2009

Комментарии 12

Прикольно =).
Люди мучаются из 5ти выйти…а тут приора разгон 0-100…
А если рол он 100-200 =).

по секундомеру действительно получилось разогнать 1 раз до 9.7 второй раз 9.5 но это по секундомеру а в реале получится не меньше 10 сек 10.5 сек даю 100% гарантии что будет такое время по прибору, если просто чип, гбо и шумка то неплохо

ну по прибору у всех больше будет, да и этот чип ни фига не делает, есть мысля раскачать двигатель, уже все выбрал осталось дело за малым; купить, поставить и откатать онлайн😂 тогда и будут замеры на dragon

по секундомеру действительно получилось разогнать 1 раз до 9.7 второй раз 9.5 но это по секундомеру а в реале получится не меньше 10 сек 10.5 сек даю 100% гарантии что будет такое время по прибору, если просто чип, гбо и шумка то неплохо

Еще и спидометр привирает)

этот момент я учел при 106 км/ч примерно будет 100 км/ч по прибору, например чтобы показать на приборе по жпс 200 км/ч надо разогнаться до 218-219 км/ч

Честно говоря, никогда особо не заморачивался разгоном до 100 (хотя это надо знать, чтобы уверенно выполнять обгоны), поэтому у меня появился вопрос…
Ваш двигатель 1,6 (98 л.с.) выдаёт этих «лошадей» на 5600 оборотах. ГБО снижает мощность где-то на 5-10%. Лишний вес полной шумоизоляции увеличивает общую массу автомобиля, что так же увеличивает время разгона.
При этом максимальный крутящий момент (145 Нм) — на 4000 оборотах. Далее крутящий момент падает, а мощность возрастает. Но толку от этого мало. Перевод бензина. Потому что мощность зависит от крутящего момента. Крутящий момент зависит от силы, прилагаемой двигателем для раскрутки маховика. Сила зависит от давления в цилиндрах. Повысить его можно, добавив турбонаддув. Есть ли он у Вас? Скорее всего нет. У Вас обычный атмосферный движок. Чиповка атмосферных движков толку не даёт. Перевод денег. Смысл тогда крутить движок до 6500 оборотов в «красной зоне»?

5-10 %это ты загнул, 3-5 и то 5 будет с пауком который уходит далеко под днище, например 4-1 паук будет объединяться в одну трубу на расстоянии на 820 мм если мерить от клапана и глушак будет прямоточным и приход этот буде на 6000

Честно говоря, никогда особо не заморачивался разгоном до 100 (хотя это надо знать, чтобы уверенно выполнять обгоны), поэтому у меня появился вопрос…
Ваш двигатель 1,6 (98 л.с.) выдаёт этих «лошадей» на 5600 оборотах. ГБО снижает мощность где-то на 5-10%. Лишний вес полной шумоизоляции увеличивает общую массу автомобиля, что так же увеличивает время разгона.
При этом максимальный крутящий момент (145 Нм) — на 4000 оборотах. Далее крутящий момент падает, а мощность возрастает. Но толку от этого мало. Перевод бензина. Потому что мощность зависит от крутящего момента. Крутящий момент зависит от силы, прилагаемой двигателем для раскрутки маховика. Сила зависит от давления в цилиндрах. Повысить его можно, добавив турбонаддув. Есть ли он у Вас? Скорее всего нет. У Вас обычный атмосферный движок. Чиповка атмосферных движков толку не даёт. Перевод денег. Смысл тогда крутить движок до 6500 оборотов в «красной зоне»?

Докрутить чуть больше на первой передаче, попасть в зону более большего крутящего момента на второй передаче

Наибольший эффект разгона — на 3 передаче. Там передаточное число КПП этому способствует.

Честно говоря, никогда особо не заморачивался разгоном до 100 (хотя это надо знать, чтобы уверенно выполнять обгоны), поэтому у меня появился вопрос…
Ваш двигатель 1,6 (98 л.с.) выдаёт этих «лошадей» на 5600 оборотах. ГБО снижает мощность где-то на 5-10%. Лишний вес полной шумоизоляции увеличивает общую массу автомобиля, что так же увеличивает время разгона.
При этом максимальный крутящий момент (145 Нм) — на 4000 оборотах. Далее крутящий момент падает, а мощность возрастает. Но толку от этого мало. Перевод бензина. Потому что мощность зависит от крутящего момента. Крутящий момент зависит от силы, прилагаемой двигателем для раскрутки маховика. Сила зависит от давления в цилиндрах. Повысить его можно, добавив турбонаддув. Есть ли он у Вас? Скорее всего нет. У Вас обычный атмосферный движок. Чиповка атмосферных движков толку не даёт. Перевод денег. Смысл тогда крутить движок до 6500 оборотов в «красной зоне»?

Да ГБО немного снижает мощность, поэтому я на бензине езжу когда максимальная динамика нужна, на газу стрелка тахометра выше 3000 не поднимается.) чип тюнинг атмосферы дает мало толку, поэтому выше я написал про это. От многих слышал что на сток валах крутить до 6500 нету смысла но это теория, но как показывает практика смысл в этом есть, как так машина едет чуть получше, сегодня постараюсь замерить такой же разгон но переключаясь на 5500

Сегодня заменил генератор, мой стал мало давать тока. Поставил на 120А.

Приора выходит из 8 секунд «до сотни»? Ну-ну… напоминает истории из 90-х когда на «зубиле» или «жигулях» ехали «полный спидометр» )).

Ты наверное не видел толковых приор. Да и запись сначала прочитай, не уверен я в этих цифрах.

1. Я ездил на других «толковых» машинах и не только на ТАЗиках. В частности из 8 секунд не выезжает даже 21106 с C20ХЕ (заметь не C20ХЕV). Что это за мотор объяснять думаю не надо? И сравни его с приоромотором. Каждая секунда меньше 10 будет даваться со всё большим трудом, выехать-же из 8 секунд будет сложнее, чем из 9.
2. Запись прочитал, иначе-бы и не написал. Обрати внимание на скобки в конце камента, они означают смех, в частности над результатами измерений. Хочешь верить — верь, главное не опозорься где-нибудь. Сравнения с к.л. «бумером» или «мерсов» видавшим и более лучшие времена не в счёт. Я в своё время на атмосферном 2.8 порвал как тузик грелку Супру 3.0 турбо, но это не значит что у меня был такой супер-мотор – просто владелец этой Супры тупо не знал что его мотор доживает последние месяцы жизни, а он его ещё и на каждом светофоре насиловал. Но что смешно – кроме меня никто с ним не рисковал погонять )), почему-то все думали что облажаются, а мне было пох, т.к. проиграть седану, спорт-купехе не западло, а вот он потом на следующем светофоре выглядел словно его пару раз в бак ассенизационной машины окунули. К чему это я? А к тому, что хочешь реальных, точных результатов – езжай на драг и там тебе дадут точный результат.

Ты наверное не видел толковых приор. Да и запись сначала прочитай, не уверен я в этих цифрах.

в россии нет машин…это факт, я про наш автопром…а толковые приоры, там половина деталей, узлов из-за «бугра»…это будет уже не приора…грубо говоря солянка получается…я побывал из-за своей «гнилой» жизни (теперь живу нормально) много где, думал вот блин у нас РФ ученые есть, они конкуренты в мире…проведя время, или валяя дурака в аспирантуре я многое осознал. просто в России не платят денег, люди за гроши пашут… короче любой косоглазый китаец(у них там коммунизм) разнесёт по любому вузовскому предмету любого русского…америкосы кто-то из телика(не буду фамилию писать, но юморист есть там один) говорит тупые! бред…они умнее наших, у нас умных васей и петей нету. сколько учился я и до сих пор учусь…я понял одно ботаны-это не русские, а любая другая нация. лан я сам хоть не русский. у нас вообще нет машин и не будет…никогда…у нас нет ботанов в РФ.

Приора выходит из 8 секунд «до сотни»? Ну-ну… напоминает истории из 90-х когда на «зубиле» или «жигулях» ехали «полный спидометр» )).

для начала надо узнать колёса какие, что стоит на машине кроме стока, чего не стоит(может нет сидений в салоне)?! потом бензин какой, какое масло в двс, давно ли менял? вес водителя! потом брать не кривую китайскую прогу и кривой айфон, а нормальный прибор и мерить ускорение до 100! я рейслоджику особо не доверяю, хотя он будет точнее что тут написали. а по поводу спутников-брехня это…не точно они мерят…знаю точно что на гранте по спидометру скорость 105 равна реально 100 км/ч, но вот если мерить обычным секундомером точность будет маленькая. опять же вышеперечисленные параметры надо учитывать, особенно если человек только только сделал хорошую промывку сам, даже раза 2-3 и масло хорошее залил…ну и пробег тоже играет роль…я не сомневаюсь, я знаю сток тазик до 127 движка ни один из 10 секунд не выедет…люди в ютубах чё только не делают, то мерят по спидометру и у них 9.7 сек сток выдаёт. в реале же это бред…если таз едет 10 сек стоковый, то другие иномарки в стоке едут 2 сек до 100 км/ч. бред!сколько ездил на тазах вообще не едут…30-40 лет чем Автоваз занимался? иномарки для народа(не гоночные как многие подумают, а серийники) уже 150 сил делали в 90-х, у нас же всё делают 118 сил на гранте спорт и то там не 118…авео 1.6 сток разорвёт эту гранту спорт…у нас России люди работать не хотят…бухают…учиться не хотят, или не умеют…я видел разных людей, многое узнал, сделал выводы…а таз=это диагноз!

ездил на авео в последней будке и ни чего особенного нету двиг сильный для своего объема 1,6 , но он не резкий и уж до гранты спорт ему не ехать!

а я мнение менять и не собираюсь…

наверное дело том что не ездил на гр спорт? хотя почему спорт не понимаю, уже давно на 1,6 снимают 125 л.с без всяких надписей спорт

наверное дело том что не ездил на гр спорт? хотя почему спорт не понимаю, уже давно на 1,6 снимают 125 л.с без всяких надписей спорт

Ауди в бородатые 80-ые снимали с атмосферной жоповозки 2.0 140 лыс., Honda давно снимает по 100 пони с литра и чем тут гордятся на ГрантеСпорт вообще не понятно. ЧТО там спортивного? Шильдики? Или то, что она едет лучше стока? Так и 2103 ехала лучше стока 2101 – значит 2103 = 2101 спорт? После Олимпиады-80 в наши гаражи ГАИшные поступили 2101 с форсированными моторами 1.6, двумя баками, облегчённые, может их назвать Жигули-спорт? 🙂
Мне это сильно напоминает Toyota Camry SE (sport edition) для рынка Пендостана – а из отличий хром-свистелка на выхлопе, решётка радиатора да чёрные шильдики SE, моторы те-же и с той-же мощностью что и ставились на сток-жоповозки Camry 🙂 это вам не S4/S6/RS4/RS6/M5/AMG от «немцев» 🙂 и даже не S-line/M-powered/Sportline от них-же :-).

для начала надо узнать колёса какие, что стоит на машине кроме стока, чего не стоит(может нет сидений в салоне)?! потом бензин какой, какое масло в двс, давно ли менял? вес водителя! потом брать не кривую китайскую прогу и кривой айфон, а нормальный прибор и мерить ускорение до 100! я рейслоджику особо не доверяю, хотя он будет точнее что тут написали. а по поводу спутников-брехня это…не точно они мерят…знаю точно что на гранте по спидометру скорость 105 равна реально 100 км/ч, но вот если мерить обычным секундомером точность будет маленькая. опять же вышеперечисленные параметры надо учитывать, особенно если человек только только сделал хорошую промывку сам, даже раза 2-3 и масло хорошее залил…ну и пробег тоже играет роль…я не сомневаюсь, я знаю сток тазик до 127 движка ни один из 10 секунд не выедет…люди в ютубах чё только не делают, то мерят по спидометру и у них 9.7 сек сток выдаёт. в реале же это бред…если таз едет 10 сек стоковый, то другие иномарки в стоке едут 2 сек до 100 км/ч. бред!сколько ездил на тазах вообще не едут…30-40 лет чем Автоваз занимался? иномарки для народа(не гоночные как многие подумают, а серийники) уже 150 сил делали в 90-х, у нас же всё делают 118 сил на гранте спорт и то там не 118…авео 1.6 сток разорвёт эту гранту спорт…у нас России люди работать не хотят…бухают…учиться не хотят, или не умеют…я видел разных людей, многое узнал, сделал выводы…а таз=это диагноз!

Я не понял — этот камент мне? Я ТАЗы и не защищаю 🙂
То, что Приора не сможет объехать с места даже средненький бизнес-седан (овощевозку) середины 90-х со средним-же мотором я это и так знаю, что-уж говорить если сравнивать одногодков 🙂 для примера на A6 4B/C5 для рынка Пендостана шли 2.8 (атмо 201 пони), 2.7 (би-турбо 254 пони до-рестайл и 250 пони рестайл) и 4.2 (атмо 280/290 пони). И это не S6 и тем более не RS6. И снаряжённый вес от 1.6 тонны и выше, притом что это вторая половина 90-х.
Насчёт GPS — по ним самолёты если что летают, для замеров координат хватает более менее, для динамики разгона не очень (цели у GPS были не те), но тоже хватает и лучше чем бухой кент с китайским секундомером в руке.
Кривая китайская прога и кривой айфон? Хех. яМобилко кривая у вас в Раше купленная где-нибудь на АлиЭкспресс :-), а у нас официальные реселлеры Эпл есть.
Если пошла речь о колёсах, то они ясен пень некисло влияют на динамику, у меня мои БЛИЗКИЕ к паспортным 7.9 показатели получаются только на нормальной летней резине от Мишлен, на всесезонке секунды 1.5 больше до сотни.
Какой бензин? Какое масло в ДВС? Давно-ли меняно? Сиденья в салоне? Сколько не корчуй ТАЗоПриору – её будут рвать как Тузик грелку корчёванные «немцы» и даже «япы».
Насчёт скорости 105 по спидометру – не поверишь но это на ВСЕХ машинах сделано специально, полистай любые автотесты, там обычно и про погрешность спидометра пишут.

Представьте себе ситуацию – вы пришли купить Лада Приору, но сомневаетесь в динамике авто. Устроить тест-драйв на месте нет возможности, что тогда делать? Специалисты рекомендуют всегда обращаться к характеристикам машины, указанным в паспорте, особенно обращая внимание на то, сколько времени необходимо для разгона до 100 км/ч. Только так можно понять, резвый автомобиль на ходу или нет.

Данные в паспорте способны отличаться от реальных значений при езде на машине, поэтому обратимся за помощью к бывалым автомобилистам, испробовавшим транспорт и поделившимся своим мнением в Интернете.

Время разгона Приоры по паспорту

В паспорте Приоры указаны такие технические показатели разгона авто:

    Если машина представляет собой модель седан, хэтчбек, универсал или купе, двигатель которого рассчитан на 1,6 л, производитель указывает время разгона 11,5 секунды. Если двигатель 1,8 л, потребуется всего 9,9 секунды.

    На рынке также можно встретить образец «Спорт», двигатель которого зафиксирован в показателе 1,6 л, а мощность – 125 л. с. С таким мотором Приора разгоняется до скорости 100 км/ч за 9,5 секунды.

    Как производитель замеряет эти значения? Ответственные на заводе два лица, вес которых в совокупности составляет до 120 кг, занимают водительское и пассажирское сиденье. В бак заливается 10 л топлива 95-й марки. Старт с места осуществляется не вхолостую, а тот, кто переключает передачи, является профессиональным водителем, прошедшим не один тест-драйв. Проводятся 10 заездов подряд, после чего выводится средний показатель, который затем округляют.

    Разгон Приоры в реальной жизни

    Желая сопоставить значения, указанные в паспорте к Приоре, владельцы машины сами садятся за руль и пытаются разгоняться до 100 км/ч. Результаты получаются совершенно разные, и все потому, что время разгона до высокой скорости зависит от нескольких факторов:

    опыт и профессионализм водителя;

    как водит автомобилист, например, на каких оборотах переключаются передачи;

    в каком состоянии находится Лада Приора, на которой проводится разгон до 100 км/ч;

    сколько весит авто;

    каковы погодные условия;

    качество дорожной трассы;

    уклон дорожной трассы;

    отлаженная работа приборов, которое осуществляют замеры разгона.

    На форумах в Интернете автолюбители телятся такими результатами:

      Приора хэтчбек в состоянии разогнаться до 100 км/ч за 11 секунд, в этом можно убедиться, просмотрев видео:

      Модернизированная Приора последних лет выпуска показывает подсчет при помощи секундомера на телефоне 12,26 и 15,12 секунды.

      Что влияет на начальное ускорение Приоры

      Начальное ускорение определяет трансмиссия, передняя включает сцепление, валы приводного типа, коробку передач, переводящей мощность и крутящий момент, поступающий от мотора на валы колес. Итого передаточные значения встречаются:

      с большим количеством зубьев на шестеренках – короткие;

      с меньшим числом зубьев – длинные.

      Чтобы добиться быстрого разгона на Ладе Приора, специалисты рекомендуют устанавливать передаточные показатели, придерживаясь короткого соотношения. Не будет лишним увеличить число главной пары до 4,3 – это позволит оторваться на светофоре.

      Лада приора разгон до 100 по паспорту


      Сколько по паспорту разгон до 100 км/час Лада Приора

      Представьте себе ситуацию – вы пришли купить Лада Приору, но сомневаетесь в динамике авто. Устроить тест-драйв на месте нет возможности, что тогда делать? Специалисты рекомендуют всегда обращаться к характеристикам машины, указанным в паспорте, особенно обращая внимание на то, сколько времени необходимо для разгона до 100 км/ч. Только так можно понять, резвый автомобиль на ходу или нет.

      Читайте также: Как снять и проверить заслонку печки Лада Приора

      Данные в паспорте способны отличаться от реальных значений при езде на машине, поэтому обратимся за помощью к бывалым автомобилистам, испробовавшим транспорт и поделившимся своим мнением в Интернете.

      Время разгона Приоры по паспорту

      В паспорте Приоры указаны такие технические показатели разгона авто:

      1. Если машина представляет собой модель седан, хэтчбек, универсал или купе, двигатель которого рассчитан на 1,6 л, производитель указывает время разгона 11,5 секунды. Если двигатель 1,8 л, потребуется всего 9,9 секунды.

      2. На рынке также можно встретить образец «Спорт», двигатель которого зафиксирован в показателе 1,6 л, а мощность – 125 л. с. С таким мотором Приора разгоняется до скорости 100 км/ч за 9,5 секунды.

      Читайте также:  Пошаговая комбинация приборов Лада Приора с навигацией

      Как производитель замеряет эти значения? Ответственные на заводе два лица, вес которых в совокупности составляет до 120 кг, занимают водительское и пассажирское сиденье. В бак заливается 10 л топлива 95-й марки. Старт с места осуществляется не вхолостую, а тот, кто переключает передачи, является профессиональным водителем, прошедшим не один тест-драйв. Проводятся 10 заездов подряд, после чего выводится средний показатель, который затем округляют.

      Разгон Приоры в реальной жизни

      Желая сопоставить значения, указанные в паспорте к Приоре, владельцы машины сами садятся за руль и пытаются разгоняться до 100 км/ч. Результаты получаются совершенно разные, и все потому, что время разгона до высокой скорости зависит от нескольких факторов:

      • опыт и профессионализм водителя;

      • как водит автомобилист, например, на каких оборотах переключаются передачи;

      • в каком состоянии находится Лада Приора, на которой проводится разгон до 100 км/ч;

      • сколько весит авто;

      • каковы погодные условия;

      • качество дорожной трассы;

      • уклон дорожной трассы;

      • отлаженная работа приборов, которое осуществляют замеры разгона.

      На форумах в Интернете автолюбители телятся такими результатами:

      1. Приора хэтчбек в состоянии разогнаться до 100 км/ч за 11 секунд, в этом можно убедиться, просмотрев видео:

      2. Модернизированная Приора последних лет выпуска показывает подсчет при помощи секундомера на телефоне 12,26 и 15,12 секунды.

      Что влияет на начальное ускорение Приоры

      Начальное ускорение определяет трансмиссия, передняя включает сцепление, валы приводного типа, коробку передач, переводящей мощность и крутящий момент, поступающий от мотора на валы колес. Итого передаточные значения встречаются:

      • с большим количеством зубьев на шестеренках – короткие;

      • с меньшим числом зубьев – длинные.

      Чтобы добиться быстрого разгона на Ладе Приора, специалисты рекомендуют устанавливать передаточные показатели, придерживаясь короткого соотношения. Не будет лишним увеличить число главной пары до 4,3 – это позволит оторваться на светофоре.

      ladaautos.ru

      Замер разгона с 0 до 100-140 -200 км в час — Лада Приора Хэтчбек, 1.5 л., 2008 года на DRIVE2

      Привезу Тюнинг запчасти под заказВсем доброго дня дорогие форумчане, наконец то выдалась возможность записать замер разгона на моей мушке, честно говоря основной причиной тому стал то факт что не раз сталкиваюсь со спорами что Приора не

      едит 200

      по паспорту 186 и все такое)Вот вчера ехал по делам за город, настроение отличное погодка просто прелесть, светит солнышко, за бортом +2,сказка, единственный нюанс резина 185 65 14,ну то ладно, с устойчивостью справимся, тем более погрешность показаний по спидометру будит сведена почти к нулю на R14.В машине только я остаток 12 литров в баке 95 Премиума, проезжая более ровный отрезок трассы определился что замерять буду тут)беру с бардачка малярный скотч и мотаю им фотик к пластиковому коробу подрулевых переключателей, единственный недостаток сильно близко и оборотов почти не видно, но иногда будит видно что стрелка тахометра заглядывает в красную зону, я думаю тахометр не особо важно, просто держать камеру в руках при такой скорости как то не комфортно-но это лично мне)Обороты как помните у меня ограничены отметкой 6400,P/S(с разу предупреждал чиповщика чтоб отсечку не сдвигал до 7000 об, мне это не надо, и так хватает)

      По движку установленная Выпускная система и впускной тракт, все контролирует Январь 7.2 не + с обкатанной прогой под приоро мотор.

      Ну и начнем, мерял с 3-х традиционных попыток, с первой не удалось сделать нормального зацепа т.к сильно даванул тапку, видюху прекратил на отметке 110 км в час, во второй попытке стартанул нормуль но на скорости 160 км в час по левой полосе ехал при свободном правом какой то извините гусь который даже не отреагировал на маяки дальнего с света))начало поднапрягать, короче 3-я попытка стартанул в натяг с 2600 об в мин, вроде нече, минимальный шлеф, а там уже тапка в пол и до 200 км в час, что характерно можно было и больше т.к слышно что она еще может но честно на зимке уже начало потаскивать)Показания по навигатору GPS не смог снять т.к фотик был примотан скотчем, короче когда ехал 200 км в час по навигатору было 193 км в час дабы небыло споров про брехливые приборки)Короче Фуууух))аж подвспотел, поехал домой видюху закидывать)По моим подсчетам до 100-ки 8 сек, до 140-ка 14 сек, до 200 км в час 35 сек, я думаю прокатит как зачет)

      Короче смотрим друзья)

      Page 2

      Привезу Тюнинг запчасти под заказВсем доброго дня дорогие форумчане, наконец то выдалась возможность записать замер разгона на моей мушке, честно говоря основной причиной тому стал то факт что не раз сталкиваюсь со спорами что Приора не

      едит 200

      по паспорту 186 и все такое)Вот вчера ехал по делам за город, настроение отличное погодка просто прелесть, светит солнышко, за бортом +2,сказка, единственный нюанс резина 185 65 14,ну то ладно, с устойчивостью справимся, тем более погрешность показаний по спидометру будит сведена почти к нулю на R14.В машине только я остаток 12 литров в баке 95 Премиума, проезжая более ровный отрезок трассы определился что замерять буду тут)беру с бардачка малярный скотч и мотаю им фотик к пластиковому коробу подрулевых переключателей, единственный недостаток сильно близко и оборотов почти не видно, но иногда будит видно что стрелка тахометра заглядывает в красную зону, я думаю тахометр не особо важно, просто держать камеру в руках при такой скорости как то не комфортно-но это лично мне)Обороты как помните у меня ограничены отметкой 6400,P/S(с разу предупреждал чиповщика чтоб отсечку не сдвигал до 7000 об, мне это не надо, и так хватает)

      По движку установленная Выпускная система и впускной тракт, все контролирует Январь 7.2 не + с обкатанной прогой под приоро мотор.

      Ну и начнем, мерял с 3-х традиционных попыток, с первой не удалось сделать нормального зацепа т.к сильно даванул тапку, видюху прекратил на отметке 110 км в час, во второй попытке стартанул нормуль но на скорости 160 км в час по левой полосе ехал при свободном правом какой то извините гусь который даже не отреагировал на маяки дальнего с света))начало поднапрягать, короче 3-я попытка стартанул в натяг с 2600 об в мин, вроде нече, минимальный шлеф, а там уже тапка в пол и до 200 км в час, что характерно можно было и больше т.к слышно что она еще может но честно на зимке уже начало потаскивать)Показания по навигатору GPS не смог снять т.к фотик был примотан скотчем, короче когда ехал 200 км в час по навигатору было 193 км в час дабы небыло споров про брехливые приборки)Короче Фуууух))аж подвспотел, поехал домой видюху закидывать)По моим подсчетам до 100-ки 8 сек, до 140-ка 14 сек, до 200 км в час 35 сек, я думаю прокатит как зачет)

      Короче смотрим друзья)

      www.drive2.ru

      Разгон до 100 км/ч — Лада Приора Седан, 1.6 л., 2007 года на DRIVE2

      Что уж скрывать, да! я хочу похвалиться и похвастаться)))) ведь не зря были потрачены мои труды!Удалось все таки зафиксировать разгон до 100 на данный момент, но сказать что доработка программы закончена еще не могу. Что имею:— Приора, 126 мотор, сток, пробег 150 тыщ. в неизвестном состоянии катализатор(— В плачевном состоянии свечи, топливный, воздушный фильтр(финансовые трудности не позволяют провести нормальное ТО)— ЭБУ Январь 7.2. программа j7es_v17.7.12 откатанная по УДК и логам.— Холодный впуск из гофры диаметром 80мм к решетке радиатора.— Машина без шумки, полный бак 95ого бензина, только водитель, колеса 185/60/14— Дорога с уклоном немного вверх!

      — Разгон замерялся по логу программой OpenOlt

      первый замер старт с лаунча с 3000 об/мин.второй старт с 4000 об/минтретий с 3500 об/минНа этих замерах 100 км/ч было на 3ей передаче, переключение с 2 на 3 на 6000 об/минпоследный замер с результатом в 9.7 сек был старт с лаунча на 3500 и 100 км/ч было на 2ой передаче, крутил почти до 7000.

      То что это было действительно 100 км/ч подтверждает даже калькулятор для расчета КПП)

      www.drive2.ru

      ВАЗ Priora I Седан — разгон до 100 км/ч

      Разгон от 0 до 100 км/ч автомобиля ВАЗ Priora I Седан в секундах.

      В таблице перечислены все возможные конфигурации данной модели и указаны базовые характеристики двигателя: объем, максимальная мощность, максимальный крутящий момент и максимальная скорость.

      Реальная скорость разгона обычно немного ниже, чем в данных, предоставленных производителем, вследствие многих факторов, таких как, например, нештатный размер колес и дисков, износ двигателя и трансмиссии, степень загрузки автомобиля, дорожные условия. Также необходимо учитывать, что показания спидометра выше реальной скорости. На 100км/ч погрешность составляет порядка 3-10км/ч.

      Модификации (3)

      Модель Конфигурация Макс. скорость Разгон 0-100 км/ч
      ВАЗ Priora I Седан 1.6 MT (81 л.с.), 120 Н*м /2700 об. (2007 — 2013) 183 км/ч 11.5 сек.
      ВАЗ Priora I Седан 1.6 MT (98 л.с.), 145 Н*м /4000 об. (2007 — 2013) 183 км/ч 11.5 сек.
      ВАЗ Priora I Седан 1.6 MT (87 л.с.), 140 Н*м /3800 об. (2011 — 2013) 176 км/ч 12.5 сек.

      Сравнить с другими авто

      Кто быстрее (15237) Марка AC Acura Alfa Romeo Alpine AM General Ariel Aro Asia Aston Martin Audi Austin Autobianchi Baltijas Dzips Beijing Bentley Bertone Bitter BMW BMW Alpina Brabus Brilliance Bristol Bufori Bugatti Buick BYD Byvin Cadillac Callaway Carbodies Caterham Changan ChangFeng Chery Chevrolet Chrysler Citroen Cizeta Coggiola Dacia Dadi Daewoo DAF Daihatsu Daimler Dallas Datsun De Tomaso DeLorean Derways Dodge DongFeng Doninvest Donkervoort E-Car Eagle Eagle Cars Ecomotors FAW Ferrari Fiat Fisker Ford Foton FSO Fuqi Geely Geo GMC Gonow Great Wall Hafei Haima Hindustan Holden Honda HuangHai Hummer Hyundai Infiniti Innocenti Invicta Iran Khodro Isdera Isuzu IVECO JAC Jaguar Jeep Jensen JMC Kia Koenigsegg KTM Lamborghini Lancia Land Rover Landwind Lexus Liebao Motor Lifan Lincoln Lotus LTI Luxgen Mahindra Marcos Marlin Marussia Maruti Maserati Maybach Mazda McLaren Mega Mercedes-Benz Mercury Metrocab MG Microcar Minelli Mini Mitsubishi Mitsuoka Morgan Morris Nissan Noble Oldsmobile Opel Osca Pagani Panoz Perodua Peugeot Piaggio Plymouth Pontiac Porsche Premier Proton PUCH Puma Qoros Qvale Reliant Renault Renault Samsung Rolls-Royce Ronart Rover Saab Saleen Santana Saturn Scion SEAT ShuangHuan Skoda Smart Soueast Spectre Spyker Ssang Yong Subaru Suzuki Talbot TATA Tatra Tazzari Tesla Tianma Tianye Tofas Toyota Trabant Tramontana Triumph TVR Vauxhall Vector Venturi Volkswagen Volvo Vortex Wartburg Westfield Wiesmann Xin Kai Zastava Zotye ZX Ё-мобиль Автокам Астро Бронто ВАЗ ГАЗ ЗАЗ ЗИЛ ИЖ КамАЗ Москвич СМЗ СеАЗ ТагАЗ УАЗ Ultima Hawtai Renaissance Модель Кто медленнее (7232)

      up-100.ru

      Одномолекулярный FRET раскрывает энергетический ландшафт полноразмерного рибопереключателя SAM-I

    1. 1

      Montange, R.K. И Бэти, Р. Структура регуляторного элемента мРНК S -аденозилметиониновый рибопереключатель. Природа 441 , 1172–1175 (2006).

      CAS PubMed Google ученый

    2. 2

      Winkler, W.C., Nahvi, A., Sudarsan, N., Barrick, J.E. & Breaker, R.R. Структура мРНК, которая контролирует экспрессию гена путем связывания S -аденозилметионина. Nat. Struct. Биол. 10 , 701–707 (2003).

      CAS PubMed Google ученый

    3. 3

      Winkler, W.C. И Брейкер Р.Р. Генетический контроль с помощью рибопереключателей, связывающих метаболит. ChemBioChem 4 , 1024–1032 (2003).

      CAS PubMed Google ученый

    4. 4

      Montange, R.K. И Бэти, Р. Рибопереключатели: новые темы в структуре и функциях РНК. Annu. Rev. Biophys. 37 , 117–133 (2008).

      CAS Google ученый

    5. 5

      Брейкер Р.Р. Перспективы открытия и анализа рибопереключателей. Мол. Ячейка 43 , 867–879 (2011).

      CAS PubMed PubMed Central Google ученый

    6. 6

      Такер, Б.Дж. и Брейкер, Р.Р. Рибопереключатели как универсальные элементы контроля генов. Curr. Opin. Struct. Биол. 15 , 342–348 (2005).

      CAS Статья Google ученый

    7. 7

      Wang, J.X. & Breaker, R.R. Рибосвитчи, распознающие S -аденозилметионин и S -аденозилгомоцистеин. Biochem. Cell Biol. 86 , 157–168 (2008).

      CAS PubMed Google ученый

    8. 8

      Trausch, J.J. et al. Структурная основа разнообразия в клане рибопереключателей SAM. Proc. Natl. Акад. Sci. США 111 , 6624–6629 (2014).

      CAS PubMed Google ученый

    9. 9

      МакДэниел Б.А., Гранди Ф.Дж., Арцимович И. и Хенкин Т.М. Контроль терминации транскрипции в системе S-бокса: прямое измерение S -аденозилметионина лидерной РНК. Proc. Natl. Акад. Sci. США 100 , 3083–3088 (2003).

      CAS Google ученый

    10. 10

      Mustoe, A.M., Brooks, C.L. И Аль-Хашими, Х. Иерархия функциональной динамики РНК. Annu. Rev. Biochem. 83 , 441–466 (2014).

      CAS PubMed PubMed Central Google ученый

    11. 11

      Фюртиг, Б., Нозинович, С., Рейнинг, А. и Швальбе, Х. Множественные конформационные состояния рибопереключателей точно настраивают регуляцию генов. Curr. Opin. Struct. Биол. 30 , 112–124 (2015).

      PubMed Google ученый

    12. 12

      Lemay, J.F., Penedo, J.C., Tremblay, R., Lilley, D.M. И Лафонтен, Д.А. Складывание рибопереключателя аденина. Chem. Биол. 13 , 857–868 (2006).

      CAS PubMed Google ученый

    13. 13

      Greenleaf, W.J., Frieda, K.L., Фостер, Д.А., Вудсайд, М. И Блок, С. Прямое наблюдение иерархического сворачивания в аптамерах с одним рибопереключателем. Наука 319 , 630–633 (2008).

      CAS PubMed PubMed Central Google ученый

    14. 14

      Wickiser, J.K., Winkler, W.C., Breaker, R.R. & Crothers, D.M. Скорость транскрипции РНК и кинетика связывания метаболитов управляют рибопереключателем FMN. Мол. Ячейка 18 , 49–60 (2005).

      CAS Google ученый

    15. 15

      Neupane, K., Yu, H., Foster, D.A., Wang, F. & Woodside, M.T. Одномолекулярная силовая спектроскопия рибопереключателя адденина связывает фолдинг с регуляторным механизмом. Nucleic Acids Res. 39 , 7677–7687 (2011).

      CAS PubMed PubMed Central Google ученый

    16. 16

      Rieder, U., Kreutz, C.& Микура, Р. Сворачивание транскрипционно действующего рибопереключателя preQ1. Proc. Natl. Акад. Sci. США 107 , 10804–10809 (2010).

      CAS PubMed Google ученый

    17. 17

      Stoddard, C.D. и другие. Конформационная выборка свободного состояния аптамерного домена рибопереключателя SAM-I. Структура 18 , 787–797 (2010).

      CAS PubMed PubMed Central Google ученый

    18. 18

      Монтанж, Р.K. et al. Дискриминация близкородственных клеточных метаболитов с помощью рибопереключателя SAM-I. J. Mol. Биол. 396 , 761–772 (2010).

      CAS Google ученый

    19. 19

      Heppell, B. & Lafontaine, D.A. Сворачивание аптамера SAM определяется образованием псевдоузла, зависящего от K-поворота. Биохимия 47 , 1490–1499 (2008).

      CAS PubMed Google ученый

    20. 20

      Хеппелл, Б.и другие. Молекулярное понимание лиганд-контролируемой организации рибопереключателя SAM-I. Nat. Chem. Биол. 7 , 384–392 (2011).

      CAS PubMed Google ученый

    21. 21

      Klein, D.J., Schmeing, T.M., Moore, P.B. И Steitz, T.A. Изгиб-поворот: новый мотив вторичной структуры РНК. EMBO J. 20 , 4214–4221 (2001).

      CAS PubMed PubMed Central Google ученый

    22. 22

      Винклер, В.К., Гранди, Ф.Дж., Мерфи, Б.А. И Хенкин Т. Мотив GA: элемент РНК, общий для бактериальных антитерминационных систем, рРНК и эукариотических РНК. РНК 7 , 1165–1172 (2001).

      CAS PubMed PubMed Central Google ученый

    23. 23

      McDaniel, B.A., Grundy, F.J. & Henkin, T.M. Третичный структурный элемент в лидерных РНК S-бокса необходим для терминации транскрипции, направленной S -аденозилметионином. Мол. Microbiol. 57 , 1008–1021 (2005).

      CAS PubMed Google ученый

    24. 24

      Lu, C. et al. Распознавание SAM и механизм конформационного переключения в блоке Bacillus subtilis yitJ S / рибопереключатель SAM-I. J. Mol. Биол. 404 , 803–818 (2010).

      CAS PubMed PubMed Central Google ученый

    25. 25

      Aboul-ela, F., Хуанг, В., Абд Эльрахман, М., Бояпати, В. и Ли, П. Связывание связывания аптамер-лиганд и складывание платформы экспрессии в рибопереключателях: перспективы механистического моделирования и дизайна. Wiley Interdiscip Rev RNA 6 , 631–650 (2015).

      CAS PubMed PubMed Central Google ученый

    26. 26

      Хеннелли С.П., Новикова И.В. И Санбонмацу, К. Платформа экспрессии и аптамер: кооперативность между Mg 2+ и лигандом в рибопереключателе SAM-I. Nucleic Acids Res. 41 , 1922–1935 (2013).

      CAS PubMed Google ученый

    27. 27

      Бояпати, В.К., Хуанг, В., Спедейл, Дж. И Абул-Эла, Ф. Основа для различения лигандов между конформациями рибопереключателя в состоянии ВКЛ и ВЫКЛ: случай рибопереключателя SAM-I. РНК 18 , 1230–1243 (2012).

      CAS PubMed PubMed Central Google ученый

    28. 28

      Фрида, К.Л. и Блок, С. Прямое наблюдение за котранскрипционным сворачиванием в адениновом рибопереключателе. Наука 338 , 397–400 (2012).

      CAS PubMed PubMed Central Google ученый

    29. 29

      Kurschat, W.C., Müller, J., Wombacher, R. & Helm, M. Оптимизация лигирования высокоструктурированных малых РНК с шинами. РНК 11 , 1909–1914 (2005).

      CAS PubMed PubMed Central Google ученый

    30. 30

      Чанг, Х.С., Гопич И.В. Быстрая FRET-спектроскопия одиночных молекул: теория и эксперимент. Phys. Chem. Chem. Phys. 16 , 18644–18657 (2014).

      CAS PubMed PubMed Central Google ученый

    31. 31

      Dammertz, K., Hengesbach, M., Helm, M., Nienhaus, G.U. & Кобицкий, А. Одномолекулярные FRET исследования эффектов противоионов на ландшафт свободной энергии митохондриальной лизиновой тРНК человека. Биохимия 50 , 3107–3115 (2011).

      CAS PubMed Google ученый

    32. 32

      Кобицки А.Ю., Нирт А., Хельм М., Йешке А. и Ниенхаус, Г.У. Mg 2+ -зависимая укладка рибозима Дильс-Альдераза, исследованная с помощью анализа FRET одной молекулы. Nucleic Acids Res. 35 , 2047–2059 (2007).

      CAS PubMed PubMed Central Google ученый

    33. 33

      Ригер Р., Кобицки, А., Зилафф, Х., Ниенхаус, Г.У. Доказательства фолдинга интермедиата в РНКазе H из экспериментов FRET с одной молекулой. ChemPhysChem 12 , 627–633 (2011).

      CAS PubMed Google ученый

    34. 34

      Hennelly, S.P. & Sanbonmatsu, K.Y. Третичные контакты управляют переключением рибопереключателя SAM-I. Nucleic Acids Res. 39 , 2416–2431 (2011).

      CAS PubMed Google ученый

    35. 35

      Пирчи, М.и другие. Флуоресцентная спектроскопия одиночных молекул отображает ландшафт сворачивания большого белка. Nat. Commun. 2 , 493 (2011).

      PubMed PubMed Central Google ученый

    36. 36

      McKinney, S.A., Joo, C. & Ha, T. Анализ траекторий FRET одиночных молекул с использованием скрытого марковского моделирования. Biophys. J. 91 , 1941–1951 (2006).

      CAS PubMed PubMed Central Google ученый

    37. 37

      Ли Т.H. Извлечение кинетической информации из данных резонансного переноса энергии флуоресценции одиночных молекул с использованием скрытых марковских моделей. J. Phys. Chem. В 113 , 11535–11542 (2009).

      CAS PubMed Google ученый

    38. 38

      Keller, B.G., Kobitski, A., Jäschke, A., Nienhaus, G.U. & Ноэ, Ф. Кинетика сложного сворачивания РНК, выявленная с помощью одномолекулярных FRET и скрытых марковских моделей. J. Am. Chem. Soc. 136 , 4534–4543 (2014).

      CAS PubMed PubMed Central Google ученый

    39. 39

      Prinz, J.H. и другие. Марковские модели молекулярной кинетики: создание и проверка. J. Chem. Phys. 134 , 174105 (2011).

      PubMed Google ученый

    40. 40

      Huang, W., Kim, J., Jha, S. & Aboul-Ela, F. Конформационная гетерогенность транскрипционного состояния ON рибопереключателя SAM-I: шапероноподобная роль для S -аденозилметионина . J. Mol. Биол. 418 , 331–349 (2012).

      CAS PubMed PubMed Central Google ученый

    41. 41

      Хуанг, В., Ким, Дж., Джа, С. и Абул-эла, Ф. Влияние связывания лиганда на миграцию цепи в рибопереключателе SAM-I. PLoS Comput. Биол. 9 , e1003069 (2013).

      CAS PubMed PubMed Central Google ученый

    42. 42

      Рейнинг, А.и другие. Механизм с тремя состояниями объединяет лиганд и определение температуры в рибопереключателях. Природа 499 , 355–359 (2013).

      CAS PubMed PubMed Central Google ученый

    43. 43

      Frauenfelder, H., Sligar, S.G. & Wolynes, P.G. Энергетические ландшафты и движения белков. Наука 254 , 1598–1603 (1991).

      CAS PubMed PubMed Central Google ученый

    44. 44

      Ниенхаус, Г.У., Мюллер, Дж. Д., Мак-Магон, Б. Х. И Фрауэнфельдер, Х. Изучение конформационного энергетического ландшафта белков. Physica D 107 , 297–311 (1997).

      CAS Google ученый

    45. 45

      Baird, N.J., Kulshina, N. & Ferré-D’Amaré, A.R. Функция Riboswitch: переключение переключателя или настройка диммера? РНК Biol. 7 , 328–332 (2010).

      CAS PubMed PubMed Central Google ученый

    46. 46

      Суддала, К.К., Ван, Дж., Хоу, К. и Уолтер, Н.Г. Mg 2+ сдвигает лиганд-опосредованное сворачивание рибопереключателя от индуцированного соответствия к конформационному отбору. J. Am. Chem. Soc. 137 , 14075–14083 (2015).

      CAS PubMed PubMed Central Google ученый

    47. 47

      Vogel, U. & Jensen, K.F. Скорость удлинения цепи РНК в Escherichia coli зависит от скорости роста. J. Bacteriol. 176 , 2807–2813 (1994).

      CAS PubMed PubMed Central Google ученый

    48. 48

      Huang, W., Kim, J., Jha, S. & Aboul-ela, F. Механизм S -аденозилметионина способствовал образованию конформации рибопереключателя: небольшой молекулы с сильным плечом. Nucleic Acids Res. 37 , 6528–6539 (2009).

      CAS PubMed PubMed Central Google ученый

    49. 49

      Whitford, P.C. et al. Образование нелокальной спирали является ключом к пониманию функции рибопереключателя S-аденозилметионина-1. Biophys. J. 96 , L7 – L9 (2009).

      PubMed PubMed Central Google ученый

    50. 50

      Heyes, C.D., Kobitski, A.Y., Amirgoulova, E.V. И Ниенхаус, Г.У. Биосовместимые поверхности для специфического связывания отдельных белковых молекул. J. Phys. Chem. В 108 , 13387–13394 (2004).

      CAS Google ученый

    51. 51

      Aitken, C.E., Marshall, R.A. & Puglisi, J.D. Система поглощения кислорода для улучшения стабильности красителя в экспериментах по флуоресценции одиночных молекул. Biophys. J. 94 , 1826–1835 (2008).

      CAS PubMed PubMed Central Google ученый

    52. 52

      Дэйв, Р., Терри, Д.С., Манро, Дж. Б. и Бланшар, С.C. Смягчение нежелательных фотофизических процессов для улучшения визуализации флуоресценции одиночных молекул. Biophys. J. 96 , 2371–2381 (2009).

      CAS PubMed PubMed Central Google ученый

    53. 53

      Кузьменкина Е.В., Heyes, C.D. И Ниенхаус, Г.У. Одномолекулярный резонансный перенос энергии Форстера исследование динамики белка в денатурирующих условиях. Proc. Natl. Акад. Sci. США 102 , 15471–15476 (2005).

      CAS PubMed Google ученый

    54. 54

      Сейфрид В., Бирк Х., Сторц Р. и Ульрих Х. Достижения в области мультиспектральной конфокальной визуализации. Proc. SPIE 5139 , 147–157 (2003).

      CAS Google ученый

    55. 55

      Капанидис, А.Н. и другие. Сортировка молекул с помощью флуоресценции: анализ структуры и взаимодействий с помощью переменного лазерного возбуждения отдельных молекул. Proc. Natl. Акад. Sci. США 101 , 8936–8941 (2004).

      CAS Google ученый

    56. 56

      Осборн, М.А., Баласубраманян, С., Фьюри, В.С. & Кленерман, Д. Оптически смещенная диффузия одиночных молекул изучается с помощью конфокальной флуоресцентной микроскопии. J. Phys. Chem. В 102 , 3160–3167 (1998).

      CAS Google ученый

    57. 57

      Сакка, Б.и другие. Обратимая реконфигурация нанокамер ДНК-оригами под контролем одномолекулярного FRET. Angew. Chem. Int. Эд. Англ. 54 , 3592–3597 (2015).

      PubMed Google ученый

    58. 58

      Кобицкий А.Ю., Хенгесбах М., Хельм М. и Ниенхаус, Г.У. Моделирование конформационного энергетического ландшафта РНК с помощью модификации метильной группы — исследование FRET одной молекулы. Angew. Chem. Int. Эд. Англ. 47 , 4326–4330 (2008).

      CAS PubMed Google ученый

    59. 59

      Ноэ, Ф., Хоренко, И., Шютте, К. и Смит, Дж. К. Иерархический анализ конформационной динамики в биомолекулах: переходные сети метастабильных состояний. J. Chem. Phys. 126 , 155102 (2007).

      PubMed Google ученый

    60. Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности.Если ваш браузер не принимает файлы cookie, вы не можете просматривать этот сайт.


      Настройка вашего браузера для приема файлов cookie

      Существует множество причин, по которым cookie не может быть установлен правильно. Ниже приведены наиболее частые причины:

      • В вашем браузере отключены файлы cookie. Вам необходимо сбросить настройки своего браузера, чтобы он принимал файлы cookie, или чтобы спросить вас, хотите ли вы принимать файлы cookie.
      • Ваш браузер спрашивает вас, хотите ли вы принимать файлы cookie, и вы отказались.Чтобы принять файлы cookie с этого сайта, нажмите кнопку «Назад» и примите файлы cookie.
      • Ваш браузер не поддерживает файлы cookie. Если вы подозреваете это, попробуйте другой браузер.
      • Дата на вашем компьютере в прошлом. Если часы вашего компьютера показывают дату до 1 января 1970 г., браузер автоматически забудет файл cookie. Чтобы исправить это, установите правильное время и дату на своем компьютере.
      • Вы установили приложение, которое отслеживает или блокирует установку файлов cookie.Вы должны отключить приложение при входе в систему или проконсультироваться с системным администратором.

      Почему этому сайту требуются файлы cookie?

      Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности, запоминая, что вы вошли в систему, когда переходите со страницы на страницу. Чтобы предоставить доступ без файлов cookie потребует, чтобы сайт создавал новый сеанс для каждой посещаемой страницы, что замедляет работу системы до неприемлемого уровня.


      Что сохраняется в файле cookie?

      Этот сайт не хранит ничего, кроме автоматически сгенерированного идентификатора сеанса в cookie; никакая другая информация не фиксируется.

      Как правило, в файлах cookie может храниться только информация, которую вы предоставляете, или выбор, который вы делаете при посещении веб-сайта. Например, сайт не может определить ваше имя электронной почты, пока вы не введете его. Разрешение веб-сайту создавать файлы cookie не дает этому или любому другому сайту доступа к остальной части вашего компьютера, и только сайт, который создал файл cookie, может его прочитать.

      Фёрстеровский резонансный перенос энергии в поли (2-этил-2-оксазолине), меченном флуорофором

      Полимеры, функционализированные красителем, были тщательно изучены для понимания динамики полимерных цепей, внутри- или межмолекулярной ассоциации и конформационных изменений, а также в практических приложениях, таких как усиление сигнала в диагностических тестах и ​​светособирающих антеннах.В этой работе был изучен резонансный перенос энергии Ферстера (FRET) функционализированного красителем поли (2-этил-2-оксазолина) (PEtOx) для оценки влияния расположения красителя и длины полимерной цепи на эффективность FRET. Таким образом, как α (инициирующий конец) -, так и ω (конец цепи) -флуорофор, одиночный меченый и двойной α, ω-флуоресцентный краситель, меченный PEtOx, были получены посредством катионной полимеризации с раскрытием цикла (CROP) с использованием 1- (бромметил) пирена в качестве инициатор и / или 1-пиреномасляная кислота или кумарин 343 в качестве обрывающего агента, давая четко определенный PEtOx с высокой эффективностью мечения (более 91%).Исследования флуоресценции показали, что внутримолекулярный FRET наиболее эффективен для гетеротелехелического PEtOx, содержащего как пирен, так и кумарин 343 флуорофоры в качестве концов цепи, как и ожидалось. Для этих полимеров с двойной меткой была обнаружена сильная зависимость передачи энергии от длины цепи. Полимеры были протестированы как в разбавленной органической (хлороформ), так и в водной средах, показав более высокую эффективность FRET в воде из-за улучшенных эмиссионных свойств пирена. Применение полимеров с двойной меткой в ​​качестве флуоресцентных датчиков для измерения температуры было продемонстрировано на основании поведения PEtOx при более низкой критической температуре раствора.Кроме того, из этих полимеров можно было успешно перерабатывать волокна и тонкие пленки. Важно отметить, что флуоресцентные свойства сохранялись в твердом состоянии без снижения эффективности FRET, что открывало будущие возможности для применения этих материалов в солнечных элементах и ​​/ или датчиках.

      У вас есть доступ к этой статье

      Подождите, пока мы загрузим ваш контент… Что-то пошло не так. Попробуйте еще раз?

      Цифровая сигнальная сеть управляет сборкой инфламмасома AIM2-ASC

      % PDF-1.4 % 1654 0 объект > эндобдж 1 0 объект > поток DOI: 10.1073 / pnas.1712860115application / pdf

    61. Цифровая сигнальная сеть управляет сборкой инфламмасомы AIM2-ASC
    62. 10.1073 / pnas.1712860115 http://dx.doi.org/10.1073/pnas.17128601152018-02-14false10.1073/pnas.1712860115
    63. www.pnas.org
    64. www.pnas.org
    65. 10.1073 / pnas.17128601152018-02-14false
    66. www.pnas.org
    67. 2021-03-10T02: 20: 41-08: 002021-03-10T02: 20: 41-08: 002018-02-14T13: 03: 06 + 05: 30Arbortext Advanced Print Publisher 9.1.510 / Вт UnicodeAcrobat Distiller 10.0.0 (Windows) uuid: e0cb155c-1dd1-11b2-0a00-0b09276d7200uuid: e0cb1560-1dd1-11b2-0a00-b80000000000 конечный поток эндобдж 1655 0 объект > эндобдж 80 0 объект > эндобдж 113 0 объект > / ExtGState> / Font> / ProcSet [/ PDF / Text / ImageC] / Properties> / Shading> / XObject >>> / Rotate 0 / Thumb 1718 0 R / Type / Page >> эндобдж 114 0 объект > / ExtGState> / Font> / ProcSet [/ PDF / Text / ImageC / ImageI] / Properties> / XObject >>> / Rotate 0 / Thumb 1726 0 R / Type / Page >> эндобдж 115 0 объект > / ExtGState> / Font> / ProcSet [/ PDF / Text / ImageC / ImageI] / Properties> / XObject >>> / Rotate 0 / Thumb 1659 0 R / Type / Page >> эндобдж 116 0 объект > / ExtGState> / Font> / ProcSet [/ PDF / Text / ImageC / ImageI] / Properties> / XObject >>> / Rotate 0 / Thumb 168 0 R / Type / Page >> эндобдж 117 0 объект > / ExtGState> / Font> / ProcSet [/ PDF / Text / ImageC] / Properties> / XObject >>> / Rotate 0 / Thumb 1749 0 R / Type / Page >> эндобдж 73 0 объект > / ExtGState> / Font> / ProcSet [/ PDF / Text / ImageC] / Properties> / XObject >>> / Rotate 0 / Thumb 74 0 R / Type / Page >> эндобдж 118 0 объект > / ExtGState> / Font> / ProcSet [/ PDF / Text / ImageC / ImageI] / Properties> / XObject >>> / Rotate 0 / Thumb 157 0 R / Type / Page >> эндобдж 119 0 объект > / ExtGState> / Font> / ProcSet [/ PDF / Text / ImageC / ImageI] / Properties> / XObject >>> / Rotate 0 / Thumb 1766 0 R / Type / Page >> эндобдж 120 0 объект > / ExtGState> / Font> / ProcSet [/ PDF / Text / ImageC] / Properties> / XObject >>> / Rotate 0 / Thumb 1694 0 R / Type / Page >> эндобдж 121 0 объект > / ExtGState> / Font> / ProcSet [/ PDF / Text / ImageC] / XObject >>> / Rotate 0 / Thumb 1780 0 R / Type / Page >> эндобдж 1910 0 объект > поток HWr} WHf0_V͚ + @ PBB4.d:% P

      4_Pq ~ f [iYkCHDuk

      (u, c

      (PDF) Ассимилирующий зонд на основе FRET для последовательного мониторинга в реальном времени изотермического усиления, опосредованного петлей (LAMP)

      4 (2)) : 81-100 95

      Габриэль Д., К. Аллен, М. Шелл, Т. Денни, Дж. Джин, К. Хуанг, Г. Престинг, Д. Норман, З.

      Флорес, Ю. Дуан, Дж. Редди, Дж. Эльфинстон, Л. Лю, В. Фармери, Э. Гонсалес, М. Патнаикуни,

      Б. Балог, А. Альварес, В. Малхоланд и Г. Саддлер.2005. Идентификация ORF уникальных

      для выбранного агента: Ralstonia solanacearum race 3, биовар 2. Фитопатология 95 (6): S32-S33.

      Giglio, S., P. T. Monis, and C. P. Saint. 2003. Демонстрация преимущественного связывания SYBR

      Green I со специфическими фрагментами ДНК в мультиплексной ПЦР в реальном времени. Nucleic Acids Res. 31 (22):

      e136.

      Gill, P., and A. Ghaemi. 2008. Технологии изотермической амплификации нуклеиновых кислот: обзор.

      Нуклеозиды Нуклеотиды и нуклеиновые кислоты 27 (3): 224-243.

      Gudnason, H., M. Dufva, D. D. Bang, and A. Wolff. 2007. Сравнение нескольких красителей ДНК

      для ПЦР в реальном времени: влияние концентрации красителя и состава последовательности на амплификацию ДНК

      и температуру плавления. Nucleic Acids Res. 35 (19): e127.

      Хатано Б., Т. Маки, Т. Обара, Х. Фукумото, К. Хагисава, Ю. Мацусита, А. Окутани, Б.

      Базарцерен, С. Иноуэ, Т. Сата и Х. Катано. 2010. ЛАМПА, использующая одноразовый карманный обогреватель

      для обнаружения сибирской язвы, высокомобильный и надежный метод борьбы с биотерроризмом.

      Japanese J. Infectious Dis. 63 (1): 36-40.

      Хейд, К. А., Дж. Стивенс, К. Дж. Ливак и П. М. Уильямс. 1996. Количественная ПЦР в реальном времени.

      Genome Res. 6 (10): 986-994.

      Hong, T. C., Q. L. Mai, D. V. Cuong, M. Parida, H. Minekawa, T. Notomi, F. Hasebe, and K.

      Morita. 2004. Разработка и оценка нового метода петлевой изотермической амплификации

      для быстрого выявления коронавируса тяжелого острого респираторного синдрома.J

      Clin. Microbiol. 42 (5): 1956-1961.

      Hsieh, T. M., C. H. Luo, F. C. Huang, J. H. Wang, L. J. Chien и G. B. Lee. 2008.

      Повышение термической однородности микротермического циклера и его применение для полимеразной цепной реакции

      . Датчики и исполнительные механизмы B 130 (2): 848-856.

      Кислинг, Т., К. Кокс, Э. А. Дэвидсон, К. Дретхен, Г. Тертер, С. Хиббард, Р. С. Ласкен, Дж.

      Лешин, Э. Сковронски и М. Даниэльсен. 2007. Последовательно-специфическое обнаружение ДНК с использованием амплификации сигнала нуклеазной эндонуклеазы

      (NESA).Nucleic Acids Res. 35 (18): e117.

      Ким, Х., С. Диксит, К. Дж. Грин и Г. В. Фарис. 2009. Нанокапельная система ПЦР в реальном времени с лазерным нагревом

      . Оптика Экспресс 17 (1): 218-227.

      Кубота Р., Б. Г. Вайн, А. М. Альварес и Д. М. Дженкинс. 2008. Обнаружение Ralstonia

      solanacearum с помощью петлевой изотермической амплификации. Phytopathology 98 (9): 1045-

      1051.

      Кубота Р., Г. Д. Пекхэм, А. М. Альварес и Д. М. Дженкинс.2009. Использование молекулярных маяков

      для прямого обнаружения ампликонов петлевой изотермической амплификации (LAMP) патогена растений

      Ralstonia solanacearum. Фитопатология 99 (6): S68-S68.

      Кубота Р., П. Лабарр, Дж. Синглтон, А. Беддо, Б. Х. Вейгл, А. М. Альварес и Д. М.

      Дженкинс. 2011a. Неинструментальная амплификация нуклеиновых кислот (NINA) для быстрого обнаружения биовара

      Ralstonia solanacearum race 3 2. Biological Eng. Пер. 4 (2): 69-80.

      Кубота Р., М. А. Шелл, Г. Д. Пекхэм, Дж. Рю, А. М. Альварес, К. Аллен и Д. М. Дженкинс.

      2011b. Вычитание генома in silico направляет разработку высокоточной диагностики

      на основе ДНК для Ralstonia solanacearum race 3, биовара 2 и бактерии, вызывающей заболевание крови. J.

      Общая патология растений 77 (3): 182-193.

      Лиен, К. Ю., В. Ю. Линь, Ю. Ф. Ли, К. Х. Ван, Г. Ю. Лей и Г. Б. Ли. 2008. Системы Microfluidic

      , интегрированные с устройством предварительной обработки образцов для быстрой амплификации нуклеиновых кислот.J.

      Microelectromech. Системы 17 (2): 288-301.

      Махджуб С., К. Вафаи и Н. Р. Бир. 2008. Быстрый микрофлюидный термоциклер для амплификации нуклеиновых кислот с цепной реакцией полимеразы

      . Intl. J. Heat and Mass Transfer 51 (9-10): 2109-

      2122.

      Maltezos, G., A. Gomez, J. Zhong, F.A. Gomez, and A. Scherer. 2008. Полимеразная цепная реакция Microfluidic

      . Applied Physics Letters 93 (24): 243901.

      Mao, F., W. Y. Leung и X.Синь. 2007. Характеристика EvaGreen и значение

      Генетически закодированный датчик лактата FRET и его использование для обнаружения эффекта Варбурга в единичных раковых клетках

      Abstract

      Лактат перемещается между клетками и внутри них, играя метаболические и сигнальные роли в здоровых тканях. Лактат также является предвестником измененного метаболизма и участвует в патогенезе воспаления, гипоксии / ишемии, нейродегенерации и рака. Многие опухолевые клетки демонстрируют высокую скорость производства лактата в присутствии кислорода, феномен, известный как эффект Варбурга, который имеет диагностическое и, возможно, терапевтическое значение.В этой статье мы представляем Laconic, генетически кодируемый датчик лактата на основе резонансной передачи энергии Форстера (FRET), разработанный на основе бактериального фактора транскрипции LldR. Лаконичный количественный показатель лактата от 1 мкМ до 10 мМ, на него не влияли глюкоза, пируват, ацетат, бета-гидроксибутират, глутамат, цитрат, α-кетоглутарат, сукцинат, малат или оксалацетат в концентрациях, обнаруженных в цитозоле млекопитающих. Экспрессируемый в астроцитах, клетках HEK и клетках глиомы T98G, датчик позволял динамически оценивать уровни лактата в отдельных клетках.Используемый в сочетании с блокатором транспортера монокарбоксилата MCT, датчик был способен различать, является ли клетка чистым продуцентом лактата или чистым потребителем лактата. Применение протокола MCT-block показало, что базальная скорость продукции лактата в клетках глиомы T98G в 3–5 раз выше, чем в нормальных астроцитах. Напротив, скорость накопления лактата в ответ на митохондриальное ингибирование азидом натрия в глиоме была в 10 раз ниже, чем в астроцитах, что согласуется с нарушенным метаболизмом опухоли.Отношение между скоростью продукции лактата и скоростью индуцированного азидом накопления лактата, которое может быть оценено обратимо и в отдельных клетках, было идентифицировано как высокочувствительный параметр эффекта Варбурга со значениями 4,1 ± 0,5 для клеток глиомы T98G. и 0,07 ± 0,007 для астроцитов. Таким образом, в этой статье описывается генетически закодированный датчик лактата и его использование для измерения концентрации лактата, потока лактата и эффекта Варбурга в отдельных клетках млекопитающих.

      Образец цитирования: San Martín A, Ceballo S, Ruminot I, Lerchundi R, Frommer WB, Barros LF (2013) Генетически закодированный датчик лактата FRET и его использование для обнаружения эффекта Варбурга в единичных раковых клетках.PLoS ONE 8 (2): e57712. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0057712

      Редактор: Мика Екабсонс, Университет Миссисипи, США

      Поступила: 24.09.2012; Принята к печати: 24 января 2013 г .; Опубликовано: 26 февраля 2013 г.

      Авторские права: © 2013 San Martín et al. Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания автора и источника.

      Финансирование: Частично поддерживается грантом Fondecyt 1100936. Centro de Estudios CientÍficos (CECs) финансируется правительством Чили через Программу базального финансирования центров передового опыта CONICYT и Gobierno Regional de Los Ros. WBF был поддержан грантом Национальных институтов здравоохранения (NIDDK; 1RO1DK079109). Финансирующие организации не играли никакой роли в дизайне исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.

      Конкурирующие интересы: Авторы заявили, что никаких конкурирующих интересов не существует.

      Введение

      Лактат представляет собой органический анион, который участвует в промежуточном метаболизме эукариотических и прокариотических клеток. В клетках млекопитающих лактат продуцируется из пирувата цитозольным ферментом лактатдегидрогеназой (ЛДГ) и обменивается с интерстициальным пространством и между субклеточными компартментами посредством транспортеров монокарбоксилата (МСТ). Гипоксические ткани и опухоли выделяют большое количество лактата, и когда-то считалось, что высвобождение лактата всегда было патологическим, но теперь становится очевидным, что в дополнение к его роли в гипоксии, лактат выполняет важные функции в здоровых насыщенных кислородом тканях.Межклеточные и субклеточные обмены лактатом, называемые лактатными челноками, являются неотъемлемой частью нормального энергетического метаболизма мышц и мозга [1], [2]. В ткани мозга, несмотря на нормальный или повышенный уровень кислорода в тканях, нервная активность сопровождается резким повышением уровня лактата в тканях. Производят ли нейроны или потребляют ли они лактат во время нейронной активности, и когда, остается спорным вопросом [3] — [7], который может значительно выиграть от измерения лактата в отдельных клетках. Кроме того, лактат поддерживает процесс миелинизации [8], может вести себя как межклеточный сигнал в сосудисто-нервном взаимодействии и ощущении натрия [9], [10], контролирует собственное производство [11] и необходим для формирования долговременной памяти [12] ], [13].Патофизиологические роли лактата включают воспаление, заживление ран, микробную инфекцию, нейродегенерацию и рак [14] — [18].

      Стандартные методы измерения лактата основаны на ферментативных реакциях, за которыми следуют фотометрические или амперометрические процедуры. Эти методы ограничены, поскольку они должны потреблять субстрат и / или требовать разрушения образца; ни один из них не способен обнаруживать внутриклеточный лактат неинвазивно в реальном времени или с разрешением отдельных клеток. В настоящей статье описывается генетически закодированный репортер лактата, использование этого репортера для определения транспорта лактата и метаболического потока с улучшенным пространственно-временным разрешением, а также разработка чувствительного параметра метаболизма рака.

      Результаты

      LldR в окружении пары FRET mTFP-Venus Сообщает [лактат]

      Генетически закодированные наносенсоры Фёрстера с резонансной передачей энергии (FRET) были разработаны для измерения динамических изменений концентрации нескольких молекул, представляющих биологический интерес, с улучшенным пространственно-временным разрешением. Сенсоры FRET представляют собой слитые белки, состоящие из лиганд-связывающего фрагмента, элемента распознавания и флуоресцентной пары с перекрывающимися спектрами излучения и возбуждения, обычно CFP и YFP.Связывание тестовой молекулы вызывает конформационное изменение, которое влияет на относительное расстояние и / или ориентацию между флуоресцентными белками, вызывая увеличение или уменьшение эффективности FRET. Описанный здесь наносенсор основан на LldR, бактериальном регуляторе транскрипции, который состоит из двух модулей: лактат-связывающего / регуляторного домена и ДНК-связывающего домена [19], [20]. Для создания лактатного сенсора мы выбрали гены LldR из Corynebacterium glutamicum и из Escherichia coli в качестве потенциальных элементов распознавания.Трехмерная структура двух белков, связывающих лактат, практически совпадает (рис. 1A), но они идентичны только на 19,4%, различаются многочисленными заряженными остатками, которые могут влиять на сканирование поверхностного заряда и, возможно, на изменение эффективности FRET [21]. . В качестве пары FRET мы выбрали mTFP [22] и Venus [23], которые, по сравнению с CFP и YFP, ярче и менее чувствительны к pH. Общая архитектура датчиков изображена на рис. 1B, где mTFP расположен на N-конце, LldR фланкирован линкерами, а Венера расположена на C-конце.Для каждого из двух генов было сконструировано восемь вариантов с использованием сайт-специфической рекомбинации. Варианты различаются наличием ДНК-связывающего домена и длиной / составом линкера (последовательности доступны на фиг. S1). Сравнительный анализ показал, что в ответ на лактат E. coli и C. glutamicum chimeras изменили соотношение своей флуоресценции в противоположном направлении, и что конструкции из E. coli были более чувствительны к лактату. Удивительно, но ДНК-связывающий домен был важен для изменения FRET.Как было показано ранее для наносенсоров глюкозы [21], сенсоры лактата без искусственных линкеров работают лучше (рис. 1C). Для дальнейшей характеристики был выбран вариант с наибольшим абсолютным изменением отношения. Этот наносенсор, названный Laconic (LACtate Optical Nano Indicator от CECs), содержит полноразмерный LldR из E. coli без искусственных линкеров. Спектр излучения Laconic характеризовался ожидаемыми пиками флуоресценции mTFP и Венеры при 492 нм и 526 нм соответственно, а также снижением эффективности FRET при связывании лактата (рис.2А). Кинетика LldR для L-лактата неизвестна. На рис. 2B показано, что Laconic обнаруживает лактат более чем на четыре порядка величины (от 1 мкМ до 10 мМ) вместо двух порядков, обеспечиваемых односайтовыми сенсорами, такими как наносенсоры глюкозы [24]. При анализе in vitro Laconic по крайней мере так же чувствителен, как лучший коммерчески доступный набор на основе ферментов. Кривые зависимости реакции от дозы лактата были определены при различных значениях pH (рис. 2C), показав небольшой эффект при кислотных значениях и более выраженный эффект при щелочных значениях.Специфичность была исследована путем воздействия на датчик панели метаболитов, и были обнаружены некоторые помехи для пирувата и цитрата (рис. 2D-I). Пируват не изменял соотношение FRET (рис. 2D), но при высоких концентрациях пируват блокировал эффект низкого лактата (рис. 2G). Физиологическая концентрация пирувата в клетках млекопитающих ниже 100 мкМ и в 10–50 раз ниже, чем у лактата [1], поэтому эндогенный пируват не должен влиять на восприятие лактата в физиологических условиях.Цитрат в концентрации 1 мМ увеличивал соотношение FRET на 6% (фиг. 2D) и уменьшал реакцию сенсора на высокий уровень лактата (фиг. 2H). Никаких эффектов не наблюдалось при 10 мкМ или 100 мкМ цитрате (фиг. 2D и 2H). Цитрат в цитозоле ниже 100 мкМ [25] — [27], и поэтому не ожидается, что он будет мешать восприятию лактата в цитозоле. Однако это может повлиять на восприятие митохондрий, поскольку содержание цитрата митохондрий в 10 раз выше. Экстремальные окислительно-восстановительные отношения, достигнутые с помощью комбинаций НАДН и НАД + [28], не оказали заметного влияния на чувствительность к лактату (рис.2I).

      Рис. 1. Лаконичный датчик лактата FRET на основе регулятора транскрипции LldR.

      (A) Кристаллографическая структура LldR из Corynebacterium glutamicum [19] и 3D-структура LldR из Escherichia coli , предсказанная с использованием LldR из C. glutamicum и FadR из E. coli 5 в качестве матриц (M Сервер 3.0 из лаборатории Fiser (http://www.fiserlab.org/servers_table.htm). (B) Общая конструкция: регулятор транскрипции LldR расположен между флуоресцентными белками mTFP и Венерой, с искусственными пептидами, разделяющими белки (синие и оранжевые линкеры).(C) Влияние 10 мМ лактата на коэффициент флуоресценции 8 вариантов лактатного сенсора на основе LldR либо из E. coli , либо из C. glutamicum . Наиболее чувствительная конструкция, указанная стрелкой, использовалась в оставшейся части исследования.

      https://doi.org/10.1371/journal.pone.0057712.g001

      Рис. 2. In vitro, характеризация Laconic.

      (A) Спектры излучения в отсутствие и в присутствии 10 мМ лактата.(B) Соотношение между mTFP и флуоресценцией Венеры (при возбуждении 430 нм) измеряли при 0, 0,001, 0,005, 0,01, 0,05, 0,1, 0,5, 1, 5 и 10 мМ лактата. Непрерывная линия соответствует наилучшему соответствию двойной прямоугольной гиперболы данным со значениями кажущейся константы диссоциации (K D ) 8 ± 2 мкМ и 830 ± 160 мкМ, и соответствующими максимальными значениями ΔR 8 ± 0,4% и 11 ± 0,4%. (C) Кривые зависимости реакции от дозы лактата измеряли при указанных значениях pH. Непрерывная линия соответствует наилучшему соответствию двойной прямоугольной гиперболы данным при pH.4. (D) Ответ сенсора на 5 мМ лактата, пирувата, ацетата, глутамата, β-гидроксибутирата и глюкозы, 1 мМ α-кетоглутарата, сукцината, малата или оксалацетата или возрастающие концентрации цитрата (0,01, 0,1 и 1 мМ). На панелях с E по I кривые зависимости реакции от дозы лактата измеряли в присутствии 1 мМ ацетата, глутамата, β-гидроксибутирата или глюкозы (E) в 1 мМ α-кетоглутарата, сукцината, малата или оксалацетата (F). , в 0,25, 1 мМ или 10 мМ пирувата (G), в 0,01, 0,1 или 1 мМ цитрате (H) и в 0.2 мкМ НАДН, 100 мкМ НАД + или 0,2 мкМ НАДН плюс 100 мкМ НАД + (I). Непрерывные линии соответствуют наилучшему соответствию двойной прямоугольной гиперболы для контрольных данных.

      https://doi.org/10.1371/journal.pone.0057712.g002

      Laconic Reports Цитозольный лактат в клетках млекопитающих

      Датчик показал ожидаемое цитозольное распределение с исключением ядра при экспрессии в клетках HEK293 (фиг. 3A). Хотя большая часть сенсора была обнаружена в цитозоле, нельзя исключить возможность локализации небольшой фракции в ядре.Однако маловероятно, что сенсор связывается с ДНК млекопитающих, поскольку этот тип регулятора транскрипции спираль-поворот-спираль не экспрессируется в клетках млекопитающих. Более конкретно, связывание LldR с прокариотической ДНК требует 17-нуклеотидной последовательности AATTGGCCCTACCAATT [20], которая, согласно бласт-анализу, отсутствует в геноме млекопитающих. Последовательность также отсутствует в эукариотических промоторах (EPD, Eukaryotic Promoters Database, ExPASy). Возможность сенсорного вмешательства в транскрипцию, которую мы не одобряем, может быть устранена путем замены Ile 23 на серин, что, как недавно сообщалось, устраняет ДНК-связывающую активность LldR [29].

      Рисунок 3. Изображение цитозольного лактата.

      (A) Клетки HEK293, экспрессирующие Laconic, изображение при 440 возбуждения / 535 испускании). Масштабная линейка составляет 20 мкм. (B) Коэффициент флуоресценции измеряли при 0,01, 0,1, 1 и 10 мМ внеклеточного лактата в клетках HEK293, обработанных метаболическими ингибиторами и проницаемых для H + , как описано в разделе «Материалы и методы». (C) Динамику флуоресценции mTFP и Венеры измеряли в присутствии 2 мМ глюкозы / 1 мМ лактата или 10 мМ пирувата, как указано.Клетка с низкой экспрессией сенсора, требующая сильного освещения, была выбрана для демонстрации нечувствительности отношения флуоресценции к фотообесцвечиванию. Коэффициент флуоресценции был преобразован в концентрацию лактата с использованием соотношения в пирувате (нулевой лактат), как описано в тексте.

      https://doi.org/10.1371/journal.pone.0057712.g003

      Для калибровки гликолиз блокировали йодуксусной кислотой, а метаболизм митохондрий блокировали ротеноном в отсутствие глюкозы, и клетка фиксировалась протонный ионофор нигерицин в буфере, богатом калием.При остановленном потоке лактата и отсутствии градиента pH МСТ использовали для уравновешивания лактата через плазматическую мембрану. Полученная калибровочная кривая (фиг. 3B) была похожа по форме на ту, что наблюдалась с очищенным белком, предполагая, что датчик in situ ведет себя так же, как in vitro . Однако изменение соотношения mTFP / Venus при всех концентрациях лактата было примерно вдвое больше, чем наблюдаемое in vitro . Мы не знаем, почему динамический диапазон сенсора выше в клетках. Возможные объяснения включают негативное вмешательство гистидиновой метки, используемой для очистки in vitro , и / или лучшую стабилизацию белка во внутриклеточной среде.Датчик не может быть откалиброван в астроцитах, потому что в этих клетках депривация глюкозы не приводит к истощению лактата, о чем свидетельствует устойчивый ответ на пируват (см. Ниже) и отсутствие ответа на низкие концентрации лактата (данные не показаны), что, возможно, объясняется устойчивым уровнем лактата. продукция из гликогена и / или различного сродства MCT. Даже в клетках HEK проницаемость MCT не является линейной, и серьезное повреждение клеток, вызванное процедурой калибровки, могло изменить сенсорный белок. По этой причине был разработан менее инвазивный протокол одноточечной калибровки, который можно применять в ходе экспериментов без повреждения клеток.Чтобы истощить клетки лактата, мы использовали свойство MCT и других способствующих транспортеров, называемое транс-ускорением или ускоренным обменом [30]. Термодинамическое равновесие MCT зависит от градиентов лактата и pH, но также зависит от градиента любого другого субстрата. Принудительный внутрь градиент пирувата применяли для увеличения количества обращенных внутрь пустых участков связывания и уменьшения числа обращенных наружу пустых участков связывания, увеличения оттока лактата и уменьшения притока лактата.Новое термодинамическое равновесие может быть достигнуто только тогда, когда соотношение внутриклеточного лактата к внеклеточному равно соотношению пирувата внутри клетки к внеклеточному. Поскольку внеклеточный лактат поддерживался близким к нулю за счет суперфузии раствора без лактата, внутриклеточный лактат, по прогнозам, будет падать, как показано на фиг. 3C. Монохлорацетат (MCA), субстрат MCT, уменьшал коэффициент флуоресценции в той же степени, что и пируват (рис. S2), указывая на то, что производство лактата из пирувата незначительно по сравнению с экструзией лактата через MCT.Это можно объяснить тем фактом, что сочетание высокого содержания пирувата и отсутствия глюкозы сильно истощает НАДН [28], [31], ограничивая реакцию ЛДГ. Измерения с помощью ферментативного набора подтвердили, что MCA снижает лактат астроцитов (рис. S2). При значении коэффициента флуоресценции при «нулевом» лактате кинетические константы определяли in vitro , и предполагая максимальное изменение коэффициента флуоресценции 38% (из кривой доза-ответ, подобранной для данных клеток HEK), данные флуоресценции были преобразованы в концентрации лактата, как показано на рис.3С. Дальнейшая валидация протокола нулевого лактата была обеспечена наблюдением, что после продолжительной депривации глюкозы / лактата в клетках HEK пируват не влиял на соотношение флуоресценции (данные не показаны), что соответствует полному истощению лактата и очень низкому уровню NADH: NAD + Соотношение присутствует в клетках, лишенных глюкозы [28], [31]. Приведенное выше свидетельство плюс наблюдение in vitro о том, что датчик не реагирует на низкий лактат в присутствии высокого содержания пирувата (рис. 2G), предполагает, что коэффициент флуоресценции в присутствии высокого содержания пирувата является хорошей оценкой нулевого лактата.Тем не менее, даже небольшой остаточный сигнал может привести к значительному смещению, поэтому рекомендуется соблюдать осторожность при использовании датчика для количественного определения лактата, особенно в астроцитах.

      Контролируя обмен лактата между клетками и интерстициальным пространством, MCT являются узловыми точками тканевого метаболизма. Поглощение 5 мМ лактата астроцитами было ингибировано на 65 ± 3% и 62 ± 7% в присутствии блокаторов MCT флоретина и парахлормеркурибензоата (pCMBS; гистограмма на рис. S3). Превращение лактата в пируват с помощью ЛДГ снизит скорость накопления лактата, но поскольку концентрации пирувата на порядок ниже, чем концентрации лактата, этот эффект должен быть небольшим.Мы не ожидаем, что буферизация лактата с помощью ЛДГ или самого датчика будет основным фактором, потому что внутриклеточный лактат, обычно в диапазоне от сотен микромолярных до миллимолярных, более распространен, чем любой из них [32], [33].

      Измерение производства и потребления лактата

      Диаграмма потоков на фиг. 4A показывает, как на внутриклеточную концентрацию лактата влияет производство гликолита, потребление митохондрий и экспорт / импорт через MCT. Скорость гликолиза в точке его входа оценивалась с помощью датчика глюкозы FRET путем блокирования транспортера глюкозы GLUT при одновременном отслеживании скорости, с которой гексокиназа истощает внутриклеточный пул глюкозы [34], метод, который служил для обнаружения быстрых изменений в астроцитах. гликолиз в ответ на нейрональные сигналы [11], [35], [36].Следуя аналогичному принципу, обмен лактата был исследован в клетках HEK293 путем нарушения устойчивого состояния с помощью блокатора MCT при измерении цитозольного лактата с помощью Laconic. В присутствии глюкозы в качестве исключительного топлива флоретин вызывал накопление внутриклеточного лактата, что свидетельствует о чистом производстве лактата, но если глюкоза была заменена лактатом, результатом было истощение лактата (рис. 4B), что свидетельствует о чистом импорте лактата. В клетках НЕК флоретин подавлял только 57 ± 5% активности МСТ (рис.S3), и поэтому занижает фактические темпы производства или потребления примерно на 40%. pCMBS был более эффективным блокатором МСТ в клетках HEK, чем флоретин, с ингибированием 96 ± 1% (фиг. S3), что дает более точную оценку продукции лактата (фиг. 4C). В астроцитах скорость продукции лактата, рассчитанная с помощью процедуры калибровки, описанной на рис. 3C, составила 2 ± 0,5 мкМ / с (n = 22 клетки в трех экспериментах), что соответствует правильному порядку величины, учитывая, что при идентичной культуре и экспериментальной В условиях, когда астроциты потребляли глюкозу со скоростью 2 мкМ / с [34], некоторая часть глюкозы окислялась до CO 2 .Острое ингибирование окислительного фосфорилирования (OXPHOS) азидом стимулировало выработку лактата в несколько раз (рис. 4D), что соответствует наблюдаемой стимуляции потребления глюкозы [34]. Контрольные измерения pH с помощью BCECF показали, что азид вызывает небольшое закисление, которое в астроцитах достигает 0,1 единицы pH за период, в течение которого определялось накопление лактата (рис. S4). К 2 мин воздействия азида три типа клеток стабилизировались при pH примерно на 0,2 единицы pH ниже контрольных значений. Влияние флоретина и pCMBS на внутриклеточный pH было меньше.Принимая во внимание умеренную чувствительность лактатного сенсора к небольшому закислению (рис. 2C), pH, по-видимому, не является значимым фактором дифференциального воздействия ингибиторов на чувствительность к лактату в астроцитах, клетках HEK293 и T98G.

      Рисунок 4. Определение метаболических потоков.

      (A) Схема метаболизма лактата. Цитозольная концентрация лактата зависит от баланса между производством гликолита, потреблением митохондриями пирувата и лактата и обменом с внеклеточным пулом лактата через МСТ.(B) Внутриклеточный лактат контролировали в отдельных клетках HEK293 во время временного воздействия флоретина (50 мкМ) в присутствии 25 мМ глюкозы (верхняя панель) или 1 мМ лактата (нижняя панель). (C) Ответы внутриклеточного лактата на временное ингибирование МСТ флоретином (50 мкМ) или pCMBS (500 мкМ) последовательно измеряли в той же самой клетке HEK293 в присутствии 25 мМ глюкозы. Прямые линии представляют собой наклоны накопления лактата, рассчитанные по линейной регрессии в течение первой минуты воздействия.Гистограмма суммирует данные трех экспериментов. (D) Эффект 5 мМ азида натрия измеряли на астроците во время воздействия 50 мкМ флоретина.

      https://doi.org/10.1371/journal.pone.0057712.g004

      Одноклеточное обнаружение метаболизма рака в реальном времени

      Раковые клетки имеют дефектные митохондрии и сильный гликолиз, явление, известное как эффект Варбурга, который также присутствует в клеточных линиях [15]. В соответствии с незначительной ролью митохондрий в производстве АТФ в раковых клетках, измерение глюкозы в реальном времени с помощью датчика глюкозы FRET [37] показало, что гликолиз в клетках глиомы T98G гораздо менее чувствителен к ингибированию OXPHOS, чем гликолиз в астроцитах (рис.S5). Таким образом, устойчивый гликолитический ответ на азид можно интерпретировать как признак того, что митохондрии играют важную роль в производстве клеточного АТФ. Обратимость эффектов азида и флоретина позволила последовательно наносить азид, флоретин и pCMBS на одну и ту же клетку. Результаты показывают, что астроциты и клетки глиомы имеют противоположные паттерны, причем астроциты сильно реагируют на азид, но слабо реагируют на флоретин / pCMBS, а клетки T98G слабо реагируют на азид и более сильно — на флоретин / pCMBS (рис.5A-D). Анализ частоты сбора данных, необходимой для точной оценки реакции на азид, описан на рисунке S6. Контрольные эксперименты показали, что, как наблюдалось в клетках HEK, в клетках глиомы T98G pCMBS является лучшим ингибитором MCT, чем флоретин (95 ± 5% и 53 ± 3% ингибирования, соответственно; рис. S3). Соотношение между базальной продукцией лактата и реакцией на ингибирование OXPHOS, измеренное в одном и том же диапазоне соотношения флуоресценции и в одной и той же клетке, должно быть нечувствительным к концентрации лактата и, следовательно, меньше зависеть от возможных различий в концентрации лактата в покое или поведении сенсоров между типами клеток.Такое соотношение, которое мы назвали индексом Варбурга, было очень чувствительным к метаболическим различиям между астроцитами и клетками глиомы. Рассчитанный с флоретином, который в большей степени недооценивает продукцию лактата в клетках глиомы и клетках HEK, чем в астроцитах (рис. S3), индекс Варбурга составлял 0,07 ± 0,01 в астроцитах, 0,74 ± 0,15 в клетках HEK и 1,7 ± 0,2 в клетках глиомы. Рассчитанный с помощью pCMBS, индекс Варбурга составил 0,07 ± 0,01 для астроцитов, 0,94 ± 0,08 для клеток HEK и 4,1 ± 0,6 для клеток глиомы (рис.5E). В исследованиях и клинических испытаниях внедряются более специфические ингибиторы MCT, которые можно использовать в микромолярных концентрациях или ниже. Было обнаружено, что AR-C155858, специфический ингибитор MCT1 и MCT2 [38], ингибирует поглощение 5 мМ лактата астроцитами на 87% (рис. S7). При использовании AR-C155858 индекс Варбурга, рассчитанный в астроцитах, составил 0,07 ± 0,006 (рис. S7). Контрольные эксперименты показали, что флоретин, азид и AR-C155858 не влияли на восприятие лактата in vitro (рис.S8). Предполагается, что pCMBS не будет взаимодействовать с сенсором, поскольку он не проникает в клетки млекопитающих.

      Рисунок 5. Метаболическая характеристика опухолевых клеток.

      (A) Астроцит, экспрессирующий Laconic, последовательно подвергали воздействию 5 мМ азида, 50 мкМ флоретина и 500 мкМ pCMBS. Прямые линии представляют собой начальные наклоны накопления лактата, рассчитанные с помощью линейной регрессии в том же диапазоне значений отношения. (B) Клетку глиомы T98G, экспрессирующую Laconic, последовательно подвергали воздействию 5 мМ азида, 50 мкМ флоретина и 500 мкМ pCMBS.Прямые линии представляют собой начальные наклоны накопления лактата, рассчитанные с помощью линейной регрессии в том же диапазоне значений отношения. (C) Резюме начальных наклонов (отношение Δ / мин), полученных в трех экспериментах типа, показанного на A и B. (D) График корреляции между скоростями накопления лактата (отношение Δ / мин) в азиде и в pCMBS. Символы представляют отдельные астроциты (белые), клетки HEK293 (серые) или клетки T98G (черные). (E) Индекс Варбурга оценивался как соотношение между скоростью производства лактата с pCMBS и накоплением лактата с азидом и использовался для окрашивания силуэта каждой ячейки в соответствии с 16-цветной справочной таблицей.На вставке показана изолированная клетка, которая находилась примерно в 100 мкм от кластера. Гистограмма суммирует данные из 3 экспериментов в каждом типе ячеек. Шкала 20 мкм. *, p <0,05 между всеми типами клеток.

      https://doi.org/10.1371/journal.pone.0057712.g005

      Обсуждение

      Мы использовали бактериальный регулятор транскрипции LldR в качестве распознающего элемента для создания Laconic, генетически закодированного биосенсора, который определяет лактат в физиологическом диапазоне.Экспрессированный в клетках млекопитающих датчик был способен к чувствительной оценке активности переносчика лактата и продукции лактата и был использован для создания нового одноклеточного параметра эффекта Варбурга, метаболического товарного знака раковых клеток. Разработка сенсора на основе LldR обеспечивает основу для создания широкого спектра новых индикаторов, поскольку суперсемейство GntR, членом которого является LldR, включает по меньшей мере 270 других факторов транскрипции, которые связывают пируват, жирные кислоты, аминокислоты, цикл TCA. промежуточные продукты и др.[19], [39], которые являются возможными элементами распознавания для генетически закодированных наносенсоров.

      Датчик был способен определять уровни лактата в диапазоне от 1 мкМ до 10 мМ. Расширенный диапазон обнаружения был неожиданным, поскольку ранее разработанные датчики метаболитов охватывают всего два порядка [40] — [43]. Сродство в основном определяется свойствами распознающего элемента, а не флуоресцентными партнерами, поэтому отличительное кинетическое поведение этого сенсора на основе LldR и его чувствительность к мМ уровням пирувата могут представлять интерес для исследователей, работающих над регуляцией транскрипции.Лаконичность дает преимущества перед альтернативными методами, в первую очередь разрешающей способностью. Для ферментативных анализов и ВЭЖХ требуется большое количество клеток, что дает достоверные данные только при наличии метаболической однородности. Настоящие ткани и даже первичные тканевые культуры представляют собой сложные смеси клеток, которые лучше всего растут и дифференцируются друг с другом, популярным примером является совместное культивирование нейронов и астроцитов. Как и другие генетически закодированные наносенсоры, Laconic может быть экспрессирован in vivo в идентифицированных типах клеток с использованием трансгенеза или вирусной трансдукции и может быть нацелен на субклеточные органеллы.Еще одним плюсом оптических измерений является то, что они не требуют разрушения образца, что позволяет проводить статистически мощные эксперименты типа «до» и «после». В дополнение к переносу МСТ, активность которых можно оценить с помощью pH-чувствительного красителя, лактат также транспортируется независимо от протонов через щелевые соединения [44] и, возможно, через полуканалы коннексина и каналы паннексина, потоки, которые невидимы для измерений pH и которые теперь можно подойти.

      Хотя подобная форма калибровочных кривых, полученных in vitro и в клетках HEK, обнадеживает, необходимая жесткость полного протокола калибровки вызывает беспокойство, и на данном этапе невозможно гарантировать, что кинетические параметры получены in vitro представляют поведение сенсора в клетках.Таким образом, данные можно рассматривать как полуколичественные и выражать в терминах отношения Δ с использованием точки нулевого лактата в качестве эталона, в идеале в экспериментах до и после, когда показатели сравниваются при аналогичных значениях отношения. Еще одним ограничением Laconic является его чувствительность к pH в щелочном диапазоне. В физиологических условиях цитозольный pH большинства клеток колеблется от 7,0 до 7,4, диапазон, в котором датчик показал незначительные изменения, но, учитывая широкий диапазон охваченных концентраций, даже относительно небольшое изменение pH может привести к ошибке в определении лактата.Если присутствует сильное изменение pH, коррекция может быть произведена с помощью красных чувствительных к pH белков или красителей, совместно загруженных в те же клетки или с помощью параллельных экспериментов BCECF. Постоянной проблемой клеточного метаболизма является степень, в которой митохондрии метаболизируют лактат вместо пирувата [45] — [47], феномен, с которым можно бороться с помощью лактатного сенсора, экспрессируемого в цитозоле. Измерение лактата в митохондриальном матриксе может оказаться более трудным из-за пониженной чувствительности Laconic к pH 7.8-8.0 среды этого отсека и возможное вмешательство цитратов. Эти ограничения, возможно, можно преодолеть с помощью мутагенеза, что продемонстрировано на чувствительности к pH сенсора NADH Peredox [28].

      В протоколе оценки продукции / потребления лактата в идеале должен использоваться обратимый ингибитор, способный блокировать проницаемость лактата, не влияя на другие мембранные белки или внутриклеточные процессы. Ни pCMBS, ни флоретин такому описанию не соответствуют, но они дополняют друг друга.pCMBS не проникает в клетку, но воздействует на многочисленные поверхностные белки, и ее действие необратимо, что исключает возможность проведения экспериментов до и после. Мы не знаем, почему астроциты были более устойчивы к pCMBS. Возможна дифференциальная чувствительность изоформ МСТ, но мы не смогли найти доказательств этого в литературе. Ожидается, что частичное ингибирование с помощью pCMBS занижает продукцию лактата в астроцитах примерно на 35%, с аналогичным смещением, внесенным в индекс Варбурга. Действие флоретина обратимо, но менее эффективно и неспецифично.Помимо ингибирования МСТ, и флоретин, и pCMBS нацелены на переносчик глюкозы GLUT, но это не должно ставить под угрозу анализ астроцитов, нейронов, раковых клеток, фибробластов, клеточных линий в целом и других клеток, которые поддерживают внутриклеточную глюкозу в состоянии покоя на уровнях> 300 мкМ [34], [37], [40]. В таких клетках уровень глюкозы значительно превышает K m гексокиназы, и потребление глюкозы остается постоянным в течение нескольких минут в присутствии блокатора GLUT [34]. Фармацевтические компании недавно разработали высокоаффинные блокаторы MCT, которые могут быть использованы для данной цели, когда они станут коммерчески доступными.Для этой статьи мы протестировали AR-C155858, специфический ингибитор MCT 1 и MCT2 [38]. При использовании с культивированными астроцитами и клетками глиомы AR-C155858 вел себя аналогично флоретину и pCMBS (рис. S6). Однако AR-C155858 не ингибирует MCT4, изоформу, важную для зрелых астроцитов, мышечных клеток и некоторых линий раковых клеток [48], [49]. Перед измерением продукции лактата эффективность выбранного ингибитора необходимо проверить с помощью анализа поглощения. В сочетании с нокдаунами MCT с использованием siRNA или shRNA, датчик лактата также можно использовать для распознавания вклада конкретных изоформ в поток лактата.

      Стимуляция гликолиза азидом объясняется прекращением выработки митохондриального АТФ, что, возможно, усугубляется дополнительным потреблением АТФ митохондриальной АТФ-синтазой, действующей в обратном направлении. Обращение АТФ-синтазы усугубит гликолитическую стимуляцию за счет дальнейшего снижения соотношения АТФ / АДФ. Добавление олигомицина, ингибитора АТФ-синтазы, к азиду может обеспечить более точную оценку стимуляции гликолиза, учитывая эндогенное потребление АТФ, происходящее в клетке до митохондриального ингибирования.Мы не думаем, что более медленное накопление лактата в ответ на азид в опухолевых клетках объясняется большей транспортной способностью лактата. В пределе начальная скорость отклонения лактата от равновесного состояния после гликолитической стимуляции зависит только от потока лактата в состоянии покоя и степени стимуляции. Поскольку раковые клетки имеют более высокие потоки покоя, чем нормальные клетки, ожидается, что начальная скорость увеличения лактата в ответ на данную гликолитическую стимуляцию будет выше. Если на практике истинная начальная скорость не может быть определена, отток лактата станет фактором, но, по прогнозам, большая способность раковых клеток к переносу лактата будет компенсироваться соизмеримым большим потоком лактата.Слабый гликолитический ответ на азид может быть связан со слабой функцией митохондрий, но также с регуляторными дефектами гликолиза. Если тип клеток не может увеличить свою скорость гликолиза в ответ на азид, его можно ошибочно принять за фенотип опухолевого типа. Однако мы считаем, что это может быть не обычным явлением, поскольку эффект Пастера, по-видимому, является универсальной особенностью здоровых клеток млекопитающих. Это связано с тем, что у большинства клеток есть внутриклеточный пул глюкозы, который вместе с пулом гликолитических промежуточных продуктов будет поддерживать выработку лактата, по крайней мере, какое-то время.Мышечные клетки имеют заметно низкие стационарные уровни глюкозы, но, как известно, они реагируют на митохондриальные ингибиторы сильной стимуляцией гликолиза за счет отложений гликогена. Между прочим, мы наблюдали, что клетки НЕК увеличивают выработку лактата в ответ на азид даже в отсутствие внеклеточной глюкозы (данные не показаны).

      Раковые клетки более гликолитичны, чем нормальные клетки, даже в присутствии кислорода, явление, впервые отмеченное Отто Варбургом, которое привлекает повышенное внимание в связи с патогенезом, диагностикой и, возможно, лечением рака [14], [15], [50] .Молекулярные механизмы, ответственные за эффект Варбурга, являются плейотропными, включая дефекты и модуляцию увеличения функции гликолитических и митохондриальных ферментов, которые различаются между типами рака и даже между клеточными линиями внутри опухоли. Существует положительная корреляция между агрессивностью опухоли / резистентностью к химиотерапии и интенсивностью эффекта Варбурга. Это явление в настоящее время обнаруживается путем сравнения уровней потребления глюкозы и кислорода или, альтернативно, уровней производства лактата и потребления кислорода, оцененных в популяциях клеток.Настоящий датчик и связанные с ним протоколы вносят свой вклад в эту область, позволяя оценить эффект Варбурга в отдельных клетках, что является полезной функцией для изучения гетерогенных популяций клеток.

      Материалы и методы

      Стандартные реагенты и ингибиторы были приобретены у Sigma. AR-C155858 был приобретен в Haoyuan Chemexpress (Шанхай)

      .

      Конструкция датчика лактата

      Бактериальную геномную ДНК выделяли с использованием системы очистки Wizard® SV. Геномную ДНК (Promega) и гены LldR амплифицировали со специфическими праймерами.Чтобы упростить стратегию клонирования в C. glutamicum , сайт BamH I был удален путем введения молчащей однонуклеотидной мутации. Для облегчения субклонирования последовательностей LldR сайты рестрикции AflII и KpnI были соответственно введены на 3 ‘и 5’ конце ампликонов. Реакции ПЦР проводили с использованием ДНК-полимеразы горячего старта KOD (Novagen), а их продукты проверяли секвенированием (Macrogen. Inc). Шестнадцать вариантов датчика лактата, восемь для E. coli и восемь для C.glutamicum , были созданы с использованием технологии рекомбинационного клонирования Gateway® (Invitrogen) в соответствии с инструкциями производителя. Вкратце, были сконструированы пять плазмидных векторов: целевой вектор и четыре входных вектора. Вектор-адресат (pDEST01) содержал основной вектор pRSET-B, в котором последовательности ДНК, кодирующие полигистидиновый хвост, mTFP и Венеру, были клонированы ниже бактериального промотора Т7. Кассета рекомбинации с введенными сайтами AflII и KpnI, амплифицированная из pDEST14 с помощью ПЦР, была вставлена ​​между последовательностями для mTFP и Венеры.Четыре вектора входа были сконструированы с использованием вектора pCR®8 / GW / TOPO TA путем клонирования последовательностей, соответствующих полному LldR из E. coli (pENTLldR01), полной длины LldR из C. glutamicum (pENTLldR02) , лиганд-связывающий домен LldR из E. coli (pENTLldR03) и лиганд-связывающий домен LldR из C. glutamicum (pENTLldR04). Наконец, шестнадцать векторов экспрессии были созданы путем рекомбинации LR между вектором-адресатом pDEST01 и каждым из четырех векторов входа с последующим условным удалением линкера между mTFP и LldR или линкера между LldR и Венерой путем переваривания векторов экспрессии с рестрикционные ферменты Kpn I и AflII.

      Очистка белка

      Шестнадцать вариантов трансформировали в E. coli BL21 (DE3). Одиночную колонию инокулировали в 100 мл среды LB со 100 мг / мл ампициллина (без IPTG) и встряхивали в темноте в течение 2–3 дней. Клетки собирали центрифугированием при 5000 об / мин (4 ° C) в течение 10 мин и разрушали ультразвуком (Hielscher Ultrasound Technology) в 5 мл трис-HCl буфера pH 8,0. Бесклеточный экстракт получали центрифугированием при 10000 об / мин (4 ° C) в течение 1 часа и фильтрованием супернатанта (0.45 мкм). Белки очищали с использованием никелевой смолы (His Bin® от Novagen) в соответствии с рекомендациями производителя. Элюированные белки количественно определяли с использованием метода Biuret и хранили при -20 ° C в 20% глицерине. Вариант, который показал наибольшее изменение соотношения флуоресценции, названный Laconic (Lactate Optical Nanosensor from CECs), был клонирован в pcDNA3.1 (-) для экспрессии в эукариотических клетках с использованием сайтов рестрикции BamH I и Hind III.

      Животные и клеточные культуры

      Используемые животные представляли собой смешанных мышей-самцов F1 (C57BL / 6J × CBA / J), содержащихся в помещении для животных в условиях SPF при комнатной температуре 20 ± 2 ° C, в цикле свет / темнота 12/12 часов со свободным доступом. к пище и воде.Эксперименты были одобрены Комитетом по уходу и использованию животных Centro de Estudios Científicos. Смешанные корковые культуры нейрональных и глиальных клеток (новорожденные в возрасте 1-3 дней) готовили, как описано [51]. Для настоящего исследования измерялись только астроциты. Клетки глиомы HEK293 и T98G были получены из Американской коллекции типовых культур и культивированы при 37 ° C в 95% воздуха / 5% CO 2 в 10% фетальной бычьей сыворотке DMEM / F12. Клетки HEK и клетки T98G трансфицировали при 60% слиянии с использованием Lipofectamine 2000 (Gibco) с эффективностью> 90% в клетках HEK и прибл.20% в клетках T98G. Астроциты трансфицировали при 60% слиянии, используя Lipofectamine 2000 (Gibco), с прим. 20% эффективности или, альтернативно, воздействие 5 × 10 6 БОЕ Ad Laconic или Ad FLII 12 Pglu600 µδ6 (серотип 5, изготовлено на заказ Vector Biolabs), которые трансдуцировали> 90% клеток. Не было очевидной разницы в поведении сенсора в астроцитах, трансфицированных плазмидой, и астроцитах, трансдуцированных аденовирусным вектором. Клетки изучали через 24–72 ч.

      Измерения флуоресценции

      Очищенных никелем белков ресуспендировали при 100 нМ во внутриклеточном буфере, содержащем (мМ): 10 NaCl, 130 KCl, 1,25 MgSO 4 и 10 HEPES, pH 7,0, и измеряли с помощью анализатора-ридера для микропланшетов (EnVision, PerkinElmer). Белки возбуждали при 430 нм, и интенсивность флуоресцентного излучения mTFP и Венеры регистрировали при 485 нм и 528 нм, соответственно. Отношение между выбросами использовалось для характеристики датчиков.Спектры излучения получали при возбуждении 430 нм с окнами 2 нм. Клетки визуализировали при комнатной температуре (22-25 ° C) в 95% -ном воздухе / 5% CO 2 -газированном растворе следующего состава (в мМ): 112 NaCl, 1,25 CaCl 2 , 1,25 MgSO 4 , 1–2 глюкозы, 10 HEPES, 24 NaHCO 3 , pH 7,4, с 3 мМ KCl (астроциты) или 5 мМ KCl (HEK293 и T98G) с использованием вертикального конфокального микроскопа Olympus FV1000, оснащенного 20-кратным иммерсионным объективом (NA 1.0) и твердотельный лазер с длиной волны 440 нм.В качестве альтернативы, клетки были визуализированы с помощью Olympus IX70 или микроскопа Olympus BX51, оборудованного иммерсионным объективом с 40-кратным увеличением (NA 1,3) или с 20-кратным иммерсионным объективом (NA 0,95). Микроскопы были оснащены монохроматорами CAIRN (Фавершам, Великобритания) и камерой Hamamatsu Orca, управляемой программным обеспечением Kinetics, или камерой Rollera, управляемой программным обеспечением Metafluor, соответственно. Для измерения соотношения наносенсоров клетки возбуждали на длине волны 430 нм в течение 0,2–0,8 с. Излучение было разделено с помощью CAIRN Optosplit, оснащенного полосовыми фильтрами на 480 ± 20 (mTFP) и 535 ± 15 нм (Venus).Соотношение между mTFP и Венерой использовалось для оценки лактата. После отдельных экспериментов определяли коэффициент флуоресценции при нулевом лактате в присутствии 10 мМ пирувата (см. Фиг. 3С). Большинство данных представлено как разница между коэффициентом флуоресценции и коэффициентом флуоресценции в присутствии пирувата, Δ (mTFP / Venus). Чтобы сгенерировать пропорциональное изображение из 8-битных изображений с вычитанием фона и избежать деления на ноль, к изображению Венеры (знаменатель) было добавлено произвольное смещение значения 5. В pH-чувствительный краситель BCECF загружали сложный эфир при 0.1 мкМ в течение 3–4 мин, и сигнал калибровали, подвергая культуры воздействию растворов с различным pH после пермеабилизации клеток 10 мкг / мл нигерицина и 20 мкг / мл грамицидина во внутриклеточном буфере. BCECF последовательно возбуждали при 440 и 490 нм (0,05 с) и отображали при 535 ± 15 нм. Для калибровки лактатного сенсора в клетках клетки HEK293 предварительно инкубировали в течение 1 часа с 500 мкМ йодуксусной кислоты для блокирования гликолиза в GAPDH [52]. Затем внеклеточный и внутриклеточный лактат уравновешивали с использованием эндогенного H + -связанного монокарбоксилатного переносчика МСТ в присутствии обменника нигерицина H + / K + (10 мкМ) и 2 мкМ ротенона во внутриклеточном буфере следующего состав (мМ): 10 NaCl, 130 KCl, 1.25 MgSO 4 , 10 HEPES pH 7,2. Внутриклеточную глюкозу измеряли датчиком FRET [37], как подробно описано в [34]. Для оценки внутриклеточного лактата с помощью другого метода,> 80% конфлюэнтных чистых культур астроцитов, выращенных на 35-миллиметровых чашках Петри, трижды промывали ледяным буфером для визуализации с добавлением 50 мкМ флоретина, а затем проницаемостью 500 мкл 10 мМ HEPES pH 7,4 и 0,1% тритона. Лактат в экстракте измеряли с помощью набора для анализа лактата Biovision в соответствии с инструкциями производителя.

      Статистический анализ

      Временные курсы без планок ошибок соответствуют одиночным ячейкам. Эксперименты повторяли от трех до шести раз по 6–18 клеток в эксперименте, если не указано иное. Регрессионный и статистический анализ проводили с помощью компьютерной программы SigmaPlot (Jandel). Различия в средних значениях парных выборок оценивали с помощью t-критерия Стьюдента. Различия между более чем двумя группами оценивались с помощью одностороннего дисперсионного анализа рангов Крускала-Уоллиса с последующим тестом Дуннса.Значения P <0,05 считались значимыми и отмечены звездочкой (*).

      Дополнительная информация

      Рисунок S1 .

      Относится к Рис.1 . Выравнивание последовательностей датчиков лактата. Восемь вариантов лактатного сенсора были созданы либо с LldR из E. coli , либо с C. glutamicum , как описано в экспериментальных процедурах. Вариант 04 из E. Coli был назван Лаконичным.Идентичные аминокислотные остатки выделены желтым.

      https://doi.org/10.1371/journal.pone.0057712.s001

      (DOC)

      Рисунок S2 .

      Относится к Рис.3 . Истощение лактата, вызванное пируватом и монохлорацетатом. (A) Астроциты последовательно подвергали воздействию 5 мМ лактата, 10 мМ пирувата и 50 мМ монохлорацетата (MCA). Промежуточные данные взяты из 5 ячеек в одном эксперименте.Гистограмма суммирует разницу между контрольными соотношениями и в присутствии пирувата или MCA для 3 отдельных экспериментов. (B) Цельноклеточный лактат оценивали с помощью ферментативного набора в астроцитарных культурах, подвергнутых воздействию 2 мМ глюкозы / 1 мМ лактата (контроль), после 5-минутного воздействия 50 мМ MCA или после 5-минутного воздействия 5 мМ лактата. Данные взяты из 3–4 отдельных определений. *, p <0,05 относительно контроля.

      https://doi.org/10.1371/journal.pone.0057712.s002

      (DOC)

      Рисунок S3 .

      Относится к Рис.4 . Ингибирование поглощения лактата флоретином и pCMBS. Клетки глиомы T98G подвергали воздействию 5 мМ лактата в отсутствие и в присутствии 50 мкМ флоретина или 500 мкМ pCMBS. Прямые линии представляют начальную кривую поглощения лактата. Гистограммы суммируют данные для 3 экспериментов в каждом типе ячеек. *, p <0,05 по флоретину.

      https://doi.org/10.1371/journal.pone.0057712.s003

      (DOC)

      Рисунок S4 .

      Относится к Рис.4 . Влияние азида, флоретина и pCMBS на pH. Внутриклеточный pH измеряли с помощью BCECF в астроцитах, подвергнутых воздействию 5 мМ азида, 50 мкМ флоретина или 500 мкМ pCMBS. Также показано контрольное подщелачивание 10 мМ хлоридом аммония. Данные взяты из 8 ячеек в одном эксперименте. Стрелки показывают время, выбранное для гистограмм ниже, которые суммируют падение внутриклеточного pH для 3 экспериментов в каждом типе клеток. Обратите внимание, что измерения накопления лактата в Рис.5 были выполнены через 30 секунд для азида, через 2 минуты для флоретина и через 4 минуты для pCMBS.

      https://doi.org/10.1371/journal.pone.0057712.s004

      (DOC)

      Рисунок S5 .

      Относится к Рис. 5 . Истощение внутриклеточной глюкозы азидом. Эффект 5 мМ азида на внутриклеточную глюкозу измеряли с помощью датчика глюкозы FRET (Bitner et al., 2010). Гистограмма представляет степень истощения глюкозы после 2 мин воздействия азида (стрелка) в 3 экспериментах с каждым типом клеток.*, p <0,05 по отношению к астроцитам и клеткам HEK293.

      https://doi.org/10.1371/journal.pone.0057712.s005

      (DOC)

      Рисунок S6 .

      относится к Рис. 5 . Влияние частоты сбора данных на оценку повышения лактата в ответ на азид. Астроциты, экспрессирующие лактатный сенсор в присутствии 2 мМ глюкозы, подвергались воздействию 5 мМ азида, в то время как коэффициент флуоресценции измерялся каждую секунду (1 Гц).Линейная функция была адаптирована к начальной фазе повышения лактата, давая расчетную скорость 0,23 мин -1 (левая панель). Когда данные были прорежены для имитации частоты сбора данных 0,1 Гц, расчетная скорость составила 0,26 мин -1 (правая панель). На нижнем графике показаны данные для 3 разных ячеек. Аналогичные результаты были получены в отдельном эксперименте.

      https://doi.org/10.1371/journal.pone.0057712.s006

      (DOC)

      Рисунок S7 .

      Относится к Рис. 5 . Оценка индекса Варбурга с AR-C155858. ( A ) Поглощение 5 мМ лактата измеряли в астроцитах в отсутствие и в присутствии 1 мкМ AR-C155858. Данные взяты из 10 ячеек в двух экспериментах. ( B ) Астроцит, экспрессирующий Laconic, последовательно подвергали воздействию 5 мМ азида и 1 мкМ AR-C155858. Прямые линии представляют собой наклоны накопления лактата, рассчитанные с помощью линейной регрессии в том же диапазоне значений отношения.Гистограмма показывает сводку наклонов (отношение Δ / мин), полученных для 10 ячеек в двух экспериментах. Рассчитанный индекс Варбурга составил 0,07 ± 0,006.

      https://doi.org/10.1371/journal.pone.0057712.s007

      (DOC)

      Рисунок S8 .

      Относится к Рис. 4 5 . Влияние флоретина, AR-C155858 и азида на восприятие лактата in vitro. Отношение mTFP / Venus измеряли в указанных условиях и выражали относительно контрольного значения в отсутствие лактата.Данные взяты из 6 определений в двух разных сенсорных экстрактах.

      https://doi.org/10.1371/journal.pone.0057712.s008

      (DOC)

      Благодарности

      Мы благодарим Карин Алегрию и Джессику Молина за техническую помощь, а также Карен Эверетт и Карлоса Кармона за критическое прочтение рукописи.

      Вклад авторов

      Задумал и спроектировал эксперименты: ASM LFB. Проведены эксперименты: ASM SC IR RL. Проанализированы данные: ASM SC IR RL WBF LFB.Предоставленные реагенты / материалы / инструменты анализа: WBF. Написал статью: LFB.

      Ссылки

      1. 1. Gladden LB (2004) Метаболизм лактата: новая парадигма для третьего тысячелетия. J Physiol 558: 5–30.
      2. 2. Брукс Г.А. (2009) Клеточно-клеточные и внутриклеточные лактатные челноки. J Physiol 587: 5591–5600. jphysiol.2009.178350 [pii]; 10.1113 / jphysiol.2009.178350 [doi].
      3. 3. Pellerin L, Bouzier-Sore AK, Aubert A, Serres S, Merle M и др.(2007) Зависимая от активности регуляция энергетического обмена астроцитами: обновленная информация. Glia 55: 1251–1262.
      4. 4. Barros LF, Deitmer JW (2010) Обеспечение глюкозы и лактата синапсом. Brain Res Rev 63: 149–159.
      5. 5. Belanger M, Allaman I, Magistretti PJ (2011) Энергетический метаболизм мозга: фокус на метаболическом сотрудничестве астроцитов и нейронов. Cell Metab 14: 724–738 S1550-4131 (11) 00420-7 [pii]; 10.1016 / j.cmet.2011.08.016
      6. 6. Wyss MT, Jolivet R, Buck A, Magistretti PJ, Weber B (2011) Доказательства in vivo лактата как источника энергии нейронов.J Neurosci 31: 7477–7485 31/20/7477 [pii]; 10.1523 / JNEUROSCI.0415-11.2011 [doi].
      7. 7. Jolivet R, Allaman I, Pellerin L, Magistretti PJ, Weber B (2010) Комментарии к недавним исследованиям моделирования метаболических взаимодействий астроцитов и нейронов. J Cereb Blood Flow Metab 30: 1982–1986 jcbfm2010132 [pii]; 10.1038 / jcbfm.2010.132 [doi].
      8. 8. Ринхольм Дж. Э., Гамильтон Н. Б., Кессарис Н., Ричардсон В. Д., Бергерсен Л. Х. и др. (2011) Регулирование развития олигодендроцитов и миелинизации глюкозой и лактатом.J Neurosci 31: 538–548 31/2/538 [pii]; 10.1523 / JNEUROSCI.3516-10.2011 [doi].
      9. 9. Attwell D, Buchan AM, Charpak S, Lauritzen M, MacVicar BA, et al. (2010) Глиальный и нейрональный контроль кровотока в головном мозге. Nature 468: 232–243 nature09613 [pii]; 10.1038 / nature09613 [doi].
      10. 10. Симидзу Х., Ватанабэ Э., Хияма Т.Ю., Нагакура А., Фудзикава А. и др. (2007) Глиальные каналы Nax контролируют передачу сигналов лактата нейронам для восприятия [Na +] мозга. Нейрон 54: 59–72.
      11. 11.Сотело-Хитшфельд Т., Фернандес-Монкада И., Баррос Л.Ф. (2012) Острый контроль с обратной связью астроцитарного гликолиза с помощью лактата. Glia 60: 674–680 10.1002 / glia.22304 [doi].
      12. 12. Сузуки А., Стерн С.А., Боздаги О., Хантли Г.В., Уокер Р.Х. и др. (2011) Транспорт лактата астроцитов и нейронов необходим для формирования долговременной памяти. Cell 144: 810–823 S0092-8674 (11) 00132-2 [pii]; 10.1016 / j.cell.2011.02.018 [doi].
      13. 13. Newman LA, Korol DL, Gold PE (2011) Лактат, продуцируемый гликогенолизом в астроцитах, регулирует обработку памяти.PLoS One 6: e28427 10.1371 / journal.pone.0028427 [doi]; PONE-D-11-12947 [pii].
      14. 14. Ganapathy V, Thangaraju M, Prasad PD (2009) Переносчики питательных веществ при раке: актуальность для гипотезы Варбурга и не только. Pharmacol Ther 121: 29-40.
      15. 15. Vander Heiden MG, Cantley LC, Thompson CB (2009) Понимание эффекта Варбурга: метаболические потребности пролиферации клеток. Наука 324: 1029–1033.
      16. 16. Теннант Д.А., Дюран Р.В., Готтлиб Э. (2010) Ориентация на метаболическую трансформацию для лечения рака.Nat Rev Cancer 10: 267–277 nrc2817 [pii]; 10.1038 / nrc2817 [doi].
      17. 17. Ли Ю., Моррисон Б. М., Ли Ю., Ленгахер С., Фара М. Х. и др. (2012) Олигодендроглии метаболически поддерживают аксоны и способствуют нейродегенерации. Nature 487: 443–448 nature11314 [pii]; 10.1038 / nature11314 [doi].
      18. 18. Funfschilling U, Supplie LM, Mahad D, Boretius S, Saab AS и др. (2012) Гликолитические олигодендроциты поддерживают миелин и долгосрочную целостность аксонов. Nature 485: 517–521 nature11007 [pii]; 10.1038 / nature11007 [doi].
      19. 19. Гао Ю.Г., Сузуки Х., Итоу Х., Чжоу Й., Танака Й. и др. (2008) Структурная и функциональная характеристика LldR из Corynebacterium glutamicum: репрессора транскрипции, участвующего в утилизации L-лактата и сахара. Nucleic Acids Res 36: 7110-7123 gkn827 [pii]; 10.1093 / nar / gkn827 [doi].
      20. 20. Агилера Л., Кампос Э., Хименес Р., Бадиа Дж., Агилар Дж. И др. (2008) Двойная роль LldR в регуляции оперона lldPRD, участвующего в метаболизме L-лактата в Escherichia coli.J Bacteriol 190: 2997–3005 JB.02013-07 [pii]; 10.1128 / JB.02013-07 [doi].
      21. 21. Деушл К., Окумото С., Фер М., Лугер Л.Л., Кожух Л. и др. (2005) Создание и оптимизация семейства генетически кодируемых сенсоров метаболитов с помощью полурациональной белковой инженерии. Protein Sci 14: 2304–2314.
      22. 22. Day RN, Booker CF, Periasamy A (2008) Характеристика улучшенного донорского флуоресцентного белка для микроскопии с резонансным переносом энергии Форстера. Дж. Биомед Опт 13: 031203 10.1117 / 1.2939094 [DOI].
      23. 23. Нагаи Т., Ибата К., Парк Э.С., Кубота М., Микошиба К. и др. (2002) Вариант желтого флуоресцентного белка с быстрым и эффективным созреванием для клеточно-биологических применений. Nat Biotechnol 20: 87–90 10.1038 / nbt0102-87 [doi]; nbt0102-87 [pii].
      24. 24. Takanaga H, Frommer WB (2010) Облегчительные переносчики плазматической мембраны функционируют во время транзита ER. FASEB J 24: 2849–2858 fj.09-146472 [pii]; 10.1096 / fj.09-146472 [doi].
      25. 25.Siess EA, Brocks DG, Wieland OH (1978) Распределение метаболитов между цитозольным и митохондриальным компартментами гепатоцитов, выделенных от накормленных крыс. Hoppe Seylers Z Physiol Chem 359: 785–798.
      26. 26. Kauppinen RA, Hiltunen JK, Hassinen IE (1982) Компартментация цитрата в связи с регуляцией гликолиза и митохондриального трансмембранного протонного электрохимического градиента потенциала в изолированном перфузируемом сердце крысы. Biochim Biophys Acta 681: 286–291 0005-2728 (82)

        -0 [pii].

      27. 27. Саха А.К., Лейбутт Д.Р., Дин Д., Ваввас Д., Себокова Е. и др. (1999) Цитрат и регуляция малонил-КоА в мышцах крысы in vivo. Am J Physiol 276: E1030 – E1037.
      28. 28. Hung YP, Albeck JG, Tantama M, Yellen G (2011) Визуализация цитозольного окислительно-восстановительного состояния NADH-NAD (+) с помощью генетически кодируемого флуоресцентного биосенсора. Cell Metab 14: 545–554 S1550-4131 (11) 00342-1 [pii]; 10.1016 / j.cmet.2011.08.012 [doi].
      29. 29. Гао Ц., Ху Ц., Чжэн З., Ма Ц., Цзян Т. и др.(2012) Утилизация лактата регулируется регулятором LldR типа FadR у Pseudomonas aeruginosa. J Bacteriol 194: 2687–2692 JB.06579-11 [pii]; 10.1128 / JB.06579-11 [doi].
      30. 30. Brown MA, Brooks GA (1994) Транстимуляция транспорта лактата из везикул сарколеммы крысы. Arch Biochem Biophys 313: 22–28 S0003-9861 (84) 71353-1 [pii]; 10.1006 / abbi.1994.1353 [doi].
      31. 31. Чжао Ю., Цзинь Дж., Ху Кью, Чжоу Х.М., Йи Дж. И др. (2011) Генетически закодированные флуоресцентные сенсоры для определения внутриклеточного НАДН.Cell Metab 14: 555–566 S1550-4131 (11) 00350-0 [pii]; 10.1016 / j.cmet.2011.09.004 [doi].
      32. 32. Maughan DW, Henkin JA, Vigoreaux JO (2005) Концентрации гликолитических ферментов и других цитозольных белков в диффундирующей фракции протеома мышц позвоночных. Mol Cell Proteomics 4: 1541-1549 M500053-MCP200 [pii]; 10.1074 / mcp.M500053-MCP200 [doi].
      33. 33. Miyawaki A, Griesbeck O, Heim R, Tsien RY (1999) Динамические и количественные измерения Ca2 + с использованием улучшенных камелеонов.Proc Natl Acad Sci U S A 96: 2135–2140.
      34. 34. Bittner CX, Loaiza A, Ruminot I, Larenas V, Sotelo-Hitschfeld T. и др. (2010) Измерение скорости гликолиза с высоким разрешением. Фронт нейроэнергетики 2: 1–11.
      35. 35. Биттнер С.Х., Вальдебенито Р., Руминот I, Лоайза А., Ларенас В. и др. (2011) Быстрая и обратимая стимуляция астроцитарного гликолиза с помощью K + и отсроченный и стойкий эффект глутамата. J Neurosci 31: 4709–4713.
      36. 36.Ruminot I, Gutiérrez R, Peña-Munzenmeyer G, Añazco C, Sotelo-Hitschfeld T, et al. (2011) NBCe1 опосредует острую стимуляцию астроцитарного гликолиза внеклеточными K + . J Neurosci 31: 14264–14271.
      37. 37. Takanaga H, Chaudhuri B, Frommer WB (2008) GLUT1 и GLUT9 как основные участники притока глюкозы в клетки HepG2, идентифицированные высокочувствительным внутримолекулярным датчиком глюкозы FRET. Biochim Biophys Acta 1778: 1091–1099.
      38. 38. Ovens MJ, Davies AJ, Wilson MC, Murray CM, Halestrap AP (2010) AR-C155858 — мощный ингибитор транспортеров монокарбоксилата MCT1 и MCT2, который связывается с внутриклеточным сайтом, включающим трансмембранные спирали 7-10.Biochem J 425: 523–530 BJ200 [pii]; 10.1042 / BJ200 [doi].
      39. 39. Георги Т., Энгельс В., Вендиш В.Ф. (2008) Регулирование использования L-лактата регулятором LldR типа FadR из Corynebacterium glutamicum. J Bacteriol 190: 963–971 JB.01147-07 [pii]; 10.1128 / JB.01147-07 [doi].
      40. 40. Фер М., Лалонд С., Лагер И., Вольф М. В., Фроммер В. Б. (2003) Визуализация in vivo динамики поглощения глюкозы в цитозоле клеток COS-7 с помощью флуоресцентных наносенсоров. J Biol Chem 278: 19127–19133.
      41. 41. Фер М., Фроммер В. Б., Лалонд С. (2002) Визуализация поглощения мальтозы живыми клетками дрожжей с помощью флуоресцентных наносенсоров. Proc Natl Acad Sci U S A 99: 9846–9851 10.1073 / pnas.142089199 [doi]; 142089199 [pii].
      42. 42. Окумото С., Лугер Л.Л., Мичева К.Д., Реймер Р.Дж., Смит С.Дж. и др. (2005) Обнаружение высвобождения глутамата из нейронов с помощью генетически закодированных наносенсоров FRET, отображаемых на поверхности. Proc Natl Acad Sci U S A 102: 8740–8745 0503274102 [pii]; 10.1073 / pnas.0503274102 [doi].
      43. 43. Lager I, Looger LL, Hilpert M, Lalonde S, Frommer WB (2006) Конверсия предполагаемого сахаросвязывающего белка Agrobacterium в датчик FRET с высокой селективностью по сахарозе. J Biol Chem 281: 30875–30883 M605257200 [pii]; 10.1074 / jbc.M605257200 [doi].
      44. 44. Rouach N, Koulakoff A, Abudara V, Willecke K, Giaume C (2008) Астроглиальные метаболические сети поддерживают синаптическую передачу в гиппокампе. Наука 322: 1551–1555.
      45. 45.Hussien R, Brooks GA (2011) Переносчик лактата митохондрий и плазматической мембраны и экспрессия изоформы лактатдегидрогеназы в линиях клеток рака молочной железы. Physiol Genomics 43: 255–264 Physiolgenomics.00177.2010 [pii]; 10.1152 / Physiolgenomics.00177.2010 [doi].
      46. 46. Hashimoto T, Hussien R, Cho HS, Kaufer D, Brooks GA (2008) Доказательства комплекса окисления лактата митохондрий в нейронах крыс: демонстрация важного компонента лактатных челноков мозга.PLoS One 3: e2915 10.1371 / journal.pone.0002915 [doi].
      47. 47. Dubouchaud H, Butterfield GE, Wolfel EE, Bergman BC, Brooks GA (2000) Тренировка на выносливость, выражение и физиология LDH, MCT1 и MCT4 в скелетных мышцах человека. Am J Physiol Endocrinol Metab 278: E571 – E579.
      48. 48. Marcillac F, Brix B, Repond C, Johren O, Pellerin L (2011) Оксид азота индуцирует экспрессию транспортера монокарбоксилата MCT4 в культивируемых астроцитах с помощью cGMP-независимой активации транскрипции.Glia 59: 1987–1995 10.1002 / glia.21240 [doi].
      49. 49. Dimmer KS, Friedrich B, Lang F, Deitmer JW, Broer S (2000) Низкоаффинный транспортер монокарбоксилата MCT4 адаптирован к экспорту лактата в высоко гликолитические клетки. Biochem J 350, ч. 1: 219–27: 219–227.
      50. 50. Tennant DA, Duran RV, Boulahbel H, Gottlieb E (2009) Метаболическая трансформация при раке. Канцерогенез 30: 1269–1280 bgp070 [pii]; 10.1093 / carcin / bgp070 [doi].
      51. 51. Loaiza A, Porras OH, Barros LF (2003). Глутамат вызывает быструю стимуляцию транспорта глюкозы в астроцитах, о чем свидетельствует конфокальная микроскопия в реальном времени.J Neurosci 23: 7337–7342.
      52. 52. Schmidt MM, Dringen R (2009) Дифференциальные эффекты йодацетамида и йодацетата на гликолиз и метаболизм глутатиона культивируемых астроцитов. Фронт нейроэнергетики 1: 1 10.3389 / neuro.14.001.2009 [doi].

      Dual-FRET визуализация IP 3 и Ca 2+ показала, что индуцированная Ca 2+ продукция IP 3 поддерживает длительные колебания Ca 2+ в оплодотворенных яйцах мышей

    68. 1.

      Schultz, R.M. & Kopf, G.С. Молекулярные основы активации яиц млекопитающих. Curr. Вершина. Dev. Биол. 30 , 21–62 (1995).

      CAS Статья Google ученый

    69. 2.

      Stricker, S. A. Сравнительная биология передачи сигналов кальция во время оплодотворения и активации яиц у животных. Dev. Биол. 211 , 157–176, https://doi.org/10.1006/dbio.1999.9340 (1999).

      CAS Статья PubMed Google ученый

    70. 3.

      Jones, K. T. Ca 2+ колебания активации яйца и развития эмбриона у млекопитающих. Внутр. J. Dev. Биол. 42 , 1–10 (1998).

      CAS PubMed Google ученый

    71. 4.

      Miyazaki, S., Shirakawa, H., Nakada, K. & Honda, Y. Существенная роль инозитол-1,4,5-трифосфатного рецептора / Ca 2+ канал высвобождения в Ca 2 + волн и Са 2+ колебаний при оплодотворении яиц млекопитающих. Dev. Биол. 158 , 62–78, https://doi.org/10.1006/dbio.1993.1168 (1993).

      CAS Статья PubMed Google ученый

    72. 5.

      Swann, K. & Yu, Y. Динамика колебаний кальция, которые активируют яйца млекопитающих. Внутр. J. Dev. Биол. 52 , 585–594, https://doi.org/10.1387/ijdb.072530ks (2008).

      CAS Статья PubMed Google ученый

    73. 6.

      Ducibella, T., Schultz, R.M. & Ozil, J.P. Роль сигналов кальция в раннем развитии. Семин. Cell Dev. Биол. 17 , 324–332, https://doi.org/10.1016/j.semcdb.2006.02.010 (2006).

      CAS Статья PubMed Google ученый

    74. 7.

      Lawrence, Y., Whitaker, M. & Swann, K. Слияние сперматозоидов и яйцеклеток является прелюдией к начальному увеличению Ca 2+ при оплодотворении у мыши. Разработка 124 , 233–241 (1997).

      CAS PubMed Google ученый

    75. 8.

      Miyazaki, S. et al . Блокирование волны Ca 2+ и колебания Ca 2+ антителом к ​​рецептору инозитол-1,4,5-трифосфата в оплодотворенных яйцах хомяков. Наука 257 , 251–255 (1992).

      ADS CAS Статья Google ученый

    76. 9.

      Saunders, C.М. и др. . PLC дзета: специфичный для сперматозоидов триггер колебаний Ca 2+ в яйцеклетках и развитии эмбриона. Развитие 129 , 3533–3544 (2002).

      CAS PubMed Google ученый

    77. 10.

      Swann, K. Цитозольный фактор сперматозоидов стимулирует повторяющееся увеличение кальция и имитирует оплодотворение в яйцах хомяков. Развитие 110 , 1295–1302 (1990).

      CAS PubMed Google ученый

    78. 11.

      Кокс, Л. Дж. и др. . Фосфолипаза спермы Czeta людей и яванских макак запускает колебания Ca 2+ , активацию и развитие ооцитов мышей. Репродукция 124 , 611–623 (2002).

      CAS Статья Google ученый

    79. 12.

      Kouchi, Z. et al. . Рекомбинантная фосфолипаза Czeta имеет высокую чувствительность к Ca 2+ и индуцирует колебания Ca 2+ в яйцах мышей. J. Biol. Chem. 279 , 10408–10412, https://doi.org/10.1074/jbc.M313801200 (2004).

      CAS Статья PubMed Google ученый

    80. 13.

      Knott, J. G. et al. . Интерференция показывает роль фосфолипазы Czeta сперматозоидов мышей в запуске колебаний Ca 2+ во время оплодотворения. Biol. Репродукция. 72 , 992–996, https://doi.org/10.1095/biolreprod.104.036244 (2005).

      CAS Статья PubMed Google ученый

    81. 14.

      Hirose, K., Kadowaki, S., Tanabe, M., Takeshima, H. & Iino, M. Пространственно-временная динамика инозитол-1,4,5-трифосфата, который лежит в основе комплексной мобилизации Ca 2+ узоры. Наука 284 , 1527–1530 (1999).

      ADS CAS Статья Google ученый

    82. 15.

      Сато, М., Ueda, Y., Shibuya, M. & Umezawa, Y. Размещение инозитол-1,4,5-трифосфата в ядре и дендритах нейронов с помощью генетически кодируемых флуоресцентных индикаторов. Анал. Chem. 77 , 4751–4758, https://doi.org/10.1021/ac040195j (2005).

      CAS Статья PubMed Google ученый

    83. 16.

      Halet, G., Tunwell, R., Balla, T., Swann, K. & Carroll, J. Динамика PtdIns (4,5) P (2) плазматической мембраны при оплодотворении яиц мыши . J. Cell Sci. 115 , 2139–2149 (2002).

      CAS PubMed Google ученый

    84. 17.

      Shirakawa, H., Ito, M., Sato, M., Umezawa, Y. & Miyazaki, S. Измерение внутриклеточного IP 3 во время колебаний Ca 2+ в яйцах мышей с GFP- на основе зонда FRET. Biochem. Биофиз. Res. Commun. 345 , 781–788, https://doi.org/10.1016/j.bbrc.2006.04.133 (2006).

      CAS Статья PubMed Google ученый

    85. 18.

      Kelley, G.G., Reks, S.E., Ondrako, J.M., Smrcka, A.V. & Phospholipase, C. epsilon): новый эффектор Ras. EMBO J. 20 , 743–754, https://doi.org/10.1093/emboj/20.4.743 (2001).

      CAS Статья PubMed PubMed Central Google ученый

    86. 19.

      Rebecchi, M. J. & Pentyala, S. N. Структура, функция и контроль фосфоинозитид-специфической фосфолипазы C. Physiol. Ред. 80 , 1291–1335, https://doi.org/10.1152/physrev.2000.80.4.1291 (2000).

      CAS Статья PubMed Google ученый

    87. 20.

      Rhee, S. G. & Bae, Y. S. Регулирование фосфоинозитид-специфических изоферментов фосфолипазы C. J. Biol. Chem. 272 , 15045–15048 (1997).

      CAS Статья Google ученый

    88. 21.

      Арутюнян, А.Т. и др. . Цитозольные колебания Ca 2+ в фибробластах REF52: стимулирование Ca 2+ IP 3 продукция или потенциал-зависимые каналы Ca 2+ как ключевые элементы положительной обратной связи. Cell Calcium 12 , 153–164 (1991).

      CAS Статья Google ученый

    89. 22.

      Мейер Т. и Страйер Л. Молекулярная модель стимулированного рецепторами пика кальция. Proc.Natl. Акад. Sci. США 85 , 5051–5055 (1988).

      ADS CAS Статья Google ученый

    90. 23.

      Игараши, Х., Нотт, Дж. Г., Шульц, Р. М. и Уильямс, К. Дж. Изменения PLCbeta1 в яйцах мышей изменяют колебательное поведение кальция после оплодотворения. Dev. Биол. 312 , 321–330, https://doi.org/10.1016/j.ydbio.2007.09.028 (2007).

      CAS Статья PubMed PubMed Central Google ученый

    91. 24.

      Де Янг, Г. В. и Кейзер, Дж. Модель на основе инозитол-1,4,5-трифосфатного рецептора для стимулированных агонистами колебаний в концентрации Ca 2+ . Proc. Natl. Акад. Sci. США 89 , 9895–9899 (1992).

      ADS Статья Google ученый

    92. 25.

      Мацу-ура Т. и др. . Динамика цитозольного инозитол-1,4,5-трифосфата при внутриклеточных колебаниях кальция в живых клетках. J. Cell Biol. 173 , 755–765, https://doi.org/10.1083/jcb.200512141 (2006).

      CAS Статья PubMed PubMed Central Google ученый

    93. 26.

      Ganesan, S., Ameer-Beg, SM, Ng, TT, Vojnovic, B. & Wouters, FS Резонансный энергоакцепторный хромопротеин (REACh) на основе темно-желтого флуоресцентного белка (YFP) для резонанса Форстера передача энергии с помощью GFP. Proc. Natl. Акад. Sci.США 103 , 4089–4094, https://doi.org/10.1073/pnas.0509922103 (2006).

      ADS CAS Статья PubMed Google ученый

    94. 27.

      Nagai, T., Yamada, S., Tominaga, T., Ichikawa, M. & Miyawaki, A. Расширенный динамический диапазон флуоресцентных индикаторов для Ca 2+ за счет циркулярно пермутированных желтых флуоресцентных белков. Proc. Natl. Акад. Sci. США 101 , 10554–10559, https: // doi.org / 10.1073 / pnas.0400417101 (2004).

      ADS CAS Статья PubMed Google ученый

    95. 28.

      Shinohara, T. et al . Механические основы колоколообразной зависимости гейтирования инозитол-1,4,5-трифосфатного рецептора от цитозольного кальция. Proc. Natl. Акад. Sci. США 108 , 15486–15491, https://doi.org/10.1073/pnas.1101677108 (2011).

      ADS Статья PubMed Google ученый

    96. 29.

      Nezu, A., Tanimura, A., Morita, T., Shitara, A. & Tojyo, Y. Новый флуоресцентный метод с использованием биосенсора LIBRA на основе FRET для идентификации лигандов инозитола 1,4, 5-трифосфатные рецепторы. Биохим. Биофиз. Acta 1760 , 1274–1280, https://doi.org/10.1016/j.bbagen.2006.04.004 (2006).

      CAS Статья PubMed Google ученый

    97. 30.

      Ремус, Т. П. и др. .Биосенсоры для измерения концентрации инозитол-1,4,5-трифосфата в живых клетках с пространственно-временным разрешением. J. Biol. Chem. 281 , 608–616, https://doi.org/10.1074/jbc.M509645200 (2006).

      CAS Статья PubMed Google ученый

    98. 31.

      Тейлор, К. В. и Тови, С. С. Рецепторы IP (3): к пониманию их активации. Колд Спринг Харб. Перспектива. Биол. 2 , a004010, https: // doi.org / 10.1101 / cshperspect.a004010 (2010 г.).

      CAS Статья PubMed PubMed Central Google ученый

    99. 32.

      Bezprozvanny, I., Watras, J. & Ehrlich, B. E. Колоколообразные кривые кальциевого ответа Ins (1,4,5) P3- и кальций-управляемых каналов из эндоплазматического ретикулума мозжечка. Nature 351 , 751–754, https://doi.org/10.1038/351751a0 (1991).

      ADS CAS Статья PubMed Google ученый

    100. 33.

      Дегучи, Р., Сиракава, Х., Ода, С., Мохри, Т. и Миядзаки, С. Пространственно-временной анализ волн Ca 2+ по отношению к месту проникновения сперматозоидов и оси животное-растительность во время Ca 2 + колебаний в оплодотворенных яйцах мышей. Dev. Биол. 218 , 299–313, https://doi.org/10.1006/dbio.1999.9573 (2000).

      CAS Статья PubMed Google ученый

    101. 34.

      Джейкоб Р., Мерритт Дж.Е., Халлам, Т. Дж. И Ринк, Т. Дж. Повторяющиеся всплески цитоплазматического кальция, вызванные гистамином в эндотелиальных клетках человека. Nature 335 , 40–45, https://doi.org/10.1038/335040a0 (1988).

      ADS CAS Статья PubMed Google ученый

    102. 35.

      Томас, А. П., Ренард, Д. С. и Руни, Т. А. Пространственная и временная организация передачи сигналов кальция в гепатоцитах. Cell Calcium 12 , 111–126 (1991).

      CAS Статья Google ученый

    103. 36.

      Bootman, M. D. & Berridge, M. J. Субклеточный Ca 2+ сигнализирует о лежащих в основе волн и ступенчатых ответах в клетках HeLa. Curr. Биол. 6 , 855–865 (1996).

      CAS Статья Google ученый

    104. 37.

      Dupont, G., McGuinness, O.M., Johnson, M.H., Berridge, M.J. и Borgese, F.Фосфолипаза С в ооцитах мышей: характеристика бета- и гамма-изоформ и их возможное участие в сперминдуцированном всплеске Ca 2+ . Biochem. J. 316 (Pt 2), 583–591 (1996).

      CAS Статья Google ученый

    105. 38.

      Nakamura, Y. et al. . Фосфолипаза Cdelta1 необходима для фиксации клонов стволовых клеток кожи. EMBO J. 22 , 2981–2991, https: // doi.org / 10.1093 / emboj / cdg302 (2003).

      CAS Статья PubMed PubMed Central Google ученый

    106. 39.

      Fukami, K. et al . Потребность в фосфолипазе Cdelta4 для акросомной реакции, вызванной zona pellucida. Science 292 , 920–923, https://doi.org/10.1126/science.1059042 (2001).

      ADS CAS Статья PubMed Google ученый

    107. 40.

      Бай, Ю. и др. . Решающая роль фосфолипазы Cepsilon в развитии опухолей кожи, вызванных химическим канцерогеном. Cancer Res. 64 , 8808–8810, https://doi.org/10.1158/0008-5472.CAN-04-3143 (2004).

      CAS Статья PubMed Google ученый

    108. 41.

      Kim, D. et al. . Изоферменты фосфолипазы C избирательно связываются со специфическими рецепторами нейромедиаторов. Nature 389 , 290–293, https: // doi.org / 10.1038 / 38508 (1997).

      ADS CAS Статья PubMed Google ученый

    109. 42.

      Wang, S. et al. . Целенаправленное нарушение гена фосфолипазы C beta3 мыши приводит к ранней эмбриональной летальности. FEBS Lett. 441 , 261–265 (1998).

      ADS CAS Статья Google ученый

    110. 43.

      Hashimoto, A. et al. .Передний край: важная роль фосфолипазы C-гамма 2 в развитии и функционировании В-клеток. J. Immunol. 165 , 1738–1742 (2000).

      CAS Статья Google ученый

    111. 44.

      Mehlmann, L.M., Carpenter, G., Rhee, S.G. & Jaffe, L.A. Опосредованная доменом Sh3 активация фосфолипазы Cgamma не требуется для инициации высвобождения Са 2+ при оплодотворении яиц мыши. Dev. Биол. 203 , 221–232, https: // doi.org / 10.1006 / dbio.1998.9051 (1998).

      CAS Статья PubMed Google ученый

    112. 45.

      Хохрейтер Б., Гарсия А. П. и Шмид Дж. А. Флуоресцентные белки как генетически кодируемые биосенсоры FRET в науках о жизни. Sensors (Базель) 15 , 26281–26314, https://doi.org/10.3390/s151026281 (2015).

      CAS Статья Google ученый

    113. 46.

      Ниино Ю., Хотта К. и Ока К. Одновременная визуализация живых клеток с использованием двойных датчиков FRET с одним возбуждающим светом. PLoS One 4 , e6036, https://doi.org/10.1371/journal.pone.0006036 (2009).

      ADS CAS Статья PubMed PubMed Central Google ученый

    114. 47.

      Zhao, M., Wan, X., Li, Y., Zhou, W. & Peng, L. Мультиплексная 3D-визуализация FRET в глубоких тканях живых эмбрионов. Sci.Реп. 5 , 13991, https://doi.org/10.1038/srep13991 (2015).

      ADS CAS Статья PubMed PubMed Central Google ученый

    115. 48.

      Мельманн, Л. М. и Клайн, Д. Регулирование внутриклеточного кальция в яйце мышей: высвобождение кальция в ответ на сперматозоиды или трифосфат инозита усиливается после мейотического созревания. Biol. Репродукция. 51 , 1088–1098 (1994).

      CAS Статья Google ученый

    116. 49.

      Jones, KT & Nixon, VL Спермоиндуцированные колебания Ca 2+ в ооцитах и ​​яйцах мышей можно имитировать с помощью фотолиза заключенного в клетки инозитол-1,4,5-трифосфата: доказательства, подтверждающие непрерывное производство инозитола 1 на низком уровне, 4,5-трифосфат при оплодотворении млекопитающих. Dev. Биол. 225 , 1–12, https://doi.org/10.1006/dbio.2000.9826 (2000).

      CAS Статья PubMed Google ученый

    117. 50.

      Кашир, Дж., Номикос, М. и Лай, Ф. А. Осцилляции фосфолипазы С дзета и кальция при оплодотворении: доказательства, применения и дополнительные вопросы. Adv. Биол. Regul. 67 , 148–162, https://doi.org/10.1016/j.jbior.2017.10.012 (2018).

      CAS Статья PubMed Google ученый

    118. 51.

      Ларман, М. Г., Сондерс, К. М., Кэрролл, Дж., Лай, Ф. А. и Суонн, К. Зависимые от клеточного цикла колебания Са 2+ в эмбрионах мыши регулируются ядерным нацеливанием PLCzeta. J. Cell Sci. 117 , 2513–2521, https://doi.org/10.1242/jcs.01109 (2004).

      CAS Статья PubMed Google ученый

    119. 52.

      Иваи, М. и др. . Молекулярное клонирование инозитол-1,4,5-трифосфатных рецепторов типа 2 и 3 мыши и идентификация нового варианта сплайсинга рецепторов 2 типа. J. Biol. Chem. 280 , 10305–10317, https://doi.org/10.1074/jbc.M413824200 (2005).

      CAS Статья PubMed Google ученый

    120. 53.

      Нацуме, Т., Хирота, Дж., Йошикава, Ф., Фуруичи, Т. и Микошиба, К. Анализ в реальном времени взаимодействия между инозитол-1,4, 5-трифосфатным рецептором типа I и его лигандом . Biochem. Биофиз. Res. Commun. 260 , 527–533, https://doi.org/10.1006/bbrc.1999.0905 (1999).

      CAS Статья PubMed Google ученый

Добавить комментарий

Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены *