Lada 1500: О двигателях для ВАЗ -2103 (LADA 1500)

Определение ладов по Merriam-Webster

переходный глагол

c : получить, стирая вещество поток fretted канал

непереходный глагол

1а : съесть что-нибудь

3а : раздражаться или беспокоиться беспокоит из-за дороговизны кормления своих семей — Вэнс Паккард

б проточной воды : взволноваться ручей бьющий над скалами

б : изношенное или размытое пятно

переходный глагол

1а : для украшения чересстрочного рисунка

б : , чтобы сформировать узор на

2 : для обогащения тиснеными или перфорированными резными узорами

1 : орнаментальная сеть особенно : средневековая металлическая или украшенная драгоценностями сетка для женского головного убора.

2 : орнамент или орнаментальное произведение, часто рельефное, состоящее из небольших прямых полос, пересекающихся друг с другом под прямым или косым углом.

: один из ряда выступов, закрепленных на грифе струнного музыкального инструмента (например, гитары).

Платформа высокопроизводительного скрининга на основе FRET для обнаружения химических зондов, нацеленных на функции каркаса танкирас человека

Клонирование

Вставки слитых конструкций были приготовлены с помощью ПЦР с удлинением перекрытия.Экспрессионные конструкции клонировали в плазмиды pNIC28-Bsa4 (плазмида Addgene № 26103) с использованием метода клонирования без рестрикции SLIC ⁴⁴ . Вставка, кодирующая TNKS2 ARC4, была клонирована в pNIC28-MBP. Мы получили pNIC28-MBP путем вставки последовательности мальтозосвязывающего белка E. coli (UniProt ID: P0AEX9, MBP _27-392 ) между меткой His ₆ и сайтом расщепления протеазой TEV pNIC28-Bsa4. Вкратце, плазмиды pNIC28-Bsa4 или pNIC28-MBP были линеаризованы, и 100 нг линеаризованных плазмид были смешаны в молярном соотношении 1: 3 с продуктами ПЦР экспрессионных конструкций (Таблица S1) и инкубированы с полимеразой Т4 в течение 2.5 мин при комнатной температуре и 10 мин при 4 ° C. Смесь использовали для трансформации компетентных клеток NEB 5α E.coli (New England BioLabs) в соответствии с инструкциями производителя. Колонии выращивали на агаре LB, содержащем 5% сахарозы, с использованием маркера отрицательной селекции на основе SacB ^45,46 . Все конструкции были проверены секвенированием областей вставки.

Экспрессия белка

Экспрессионные конструкции основаны на pNIC28-Bsa4 или pNIC28-MBP и содержат тег His ₆ или His ₆ -MBP, соответственно, за которым следует сайт расщепления протеазой TEV перед последовательностью конструкции (ENLYFQ * SM).Плазмидой трансформировали клеток E. coli BL21 (DE3). В 500 мл аутоиндукционной среды Terrific Broth (TB), включая микроэлементы (Formedium, Hunstanton, Norfolk, England), добавляли 8 г / л глицерина и 50 мкг / мл канамицина и инокулировали 5 мл прекультуры в течение ночи. Колбы инкубировали при встряхивании при 37 ° C до достижения OD ₆₀₀ , равного 1. Температуру устанавливали на 18 ° C и инкубацию продолжали в течение ночи. Клетки собирали центрифугированием при 4200 × g в течение 30 мин при 4 ° C.Осадки ресуспендировали в буфере для лизиса (50 мМ HEPES pH 7,5, 500 мМ NaCl, 15 мМ имидазол). Для конструкций, содержащих SAM-домены, использовали другой буфер для лизиса (40 мМ бис-трис-пропан, pH 9,0, 500 мМ NaCl, 15 мМ имидазол). Ресуспендированные клетки хранили при -20 ° C до очистки.

Очистка белка

Все конструкции первоначально очищали с помощью аффинной хроматографии с иммобилизованным металлом (IMAC). Для некоторых конструкций были выполнены дополнительные стадии очистки. Клетки размораживали и лизировали ультразвуком.Лизат центрифугировали (16000 × g , 4 ° C, 30 мин), фильтровали и загружали в колонку HiTrap HP объемом 5 мл, уравновешенную буфером для лизиса, и загружали Ni ²⁺ . Колонку промывали 5 объемами колонки буфера для лизиса и 5 объемами колонки буфера для лизиса, содержащего 25 мМ имидазол. Белок элюировали буфером для лизиса, содержащим 300 мМ имидазол. Элюат IMAC с меченным MBP белком ARC4 (TNKS2) загружали в 5 мл колонку MBPTrap HP, уравновешенную загрузочным буфером MBPTrap (20 мМ HEPES, pH 7.5, 100 мМ NaCl), промывали 4 объемами колонки загрузочного буфера MBPTrap и элюировали тем же буфером, содержащим 10 мМ мальтозу. Для конструкций ARC4 (TNKS2), CFP-ARC1 (TNKS1) и CFP-ARC5 (TNKS2) — дополнительная обработка TEV-протеазой (молярное соотношение 1:30, 16 ч, 4 ° C) для удаления His ₆ — MBP- или His ₆ -тегов выполняли с последующей стадией обратного IMAC для удаления примесей. Эксклюзионную хроматографию проводили на эксклюзионной хроматографической колонке S75 16/600 с IMAC-элюатом CFP-ARC4 (TNKS1) и расщепленным TEV обратным потоком IMAC через TNKS2-ARC4 в 20 мМ HEPES pH 7.5, 500 мМ NaCl, 0,5 мМ TCEP, 10% (об. / Об.) Глицерин или 20 мМ HEPES pH 7,5, 100 мМ NaCl, 0,5 мМ TCEP, соответственно. Белки разделяли на аликвоты и быстро замораживали в жидком азоте и хранили при -70 ° C.

Измерения FRET

Измерения проводились с помощью многомодового микропланшет-ридера TECAN Infinite M1000 PRO. Использовали длину волны возбуждения 410 нм (ширина полосы 20 нм) и длину волны излучения 477 нм (ширина полосы 10 нм) и 527 нм (ширина полосы 10 нм). Количество вспышек было установлено на 50 с частотой вспышек 400 Гц.Время интегрирования составляло 20 мкс, а время установления — 10 мс. После вычитания холостого опыта для каждого измерения эмиссии вычисляли ратиометрическое значение FRET (rFRET) путем деления интенсивности флуоресценции при 527 нм на интенсивность флуоресценции при 477 нм. Для валидационного скрининга измерение было повторено с дополнительной длиной волны возбуждения 430 нм (ширина полосы 20 нм). Измерения выполняли либо в 384-луночных черных полипропиленовых планшетах с низким объемом, либо в 1536-луночных черных полистирольных планшетах от Fisherbrand.За исключением тестов оптимизации буфера, все эксперименты FRET проводились в буфере для анализа (10 мМ бис-трис-пропан, pH 7,0, 3% (мас. / Об.) PEG20,000, 0,01% (об. / Об.) Triton-X100 и 0,5 мМ TCEP).

Определение констант диссоциации

Для определения констант диссоциации конструкций FRET, слитые с CFP конструкции TNKS1 / 2 ARC или SAM (от 50 нМ до 1,1 мкМ, Фигуры S2 и S3) были смешаны с 0, 100, 200, 300 , 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 2000, 2400, 2800, 3200, 3600 и 4000 нМ YFP-TBM или TNKS1 SAM (Y1073A) — YFP или ТНК2 SAM (Y920A) -YFP соответственно.CFP-ARC3 (TNKS1) разбавляли до 7,5 мкМ в 20 мМ HEPES pH 7,5, 25 мМ NaCl, 0,5 мМ TCEP перед постановкой эксперимента, так как он показал небольшое осаждение в буфере для анализа при высоких концентрациях. Концентрации соответствующих слитых белков CFP поддерживали постоянными и выбирали так, чтобы гарантировать насыщение результирующих сигналов эмиссии FRET (сглаживание кривых). Дозирование белков производилось с помощью акустического дозатора Echo 650. Анализ данных был выполнен в GraphPad Prism 7, как описано Song et al. ³⁷ . Для расчета эмиссии FRET мы измерили эмиссию при 477 нм (ширина полосы 5 нм) и 527 нм (ширина полосы 5 нм) при возбуждении на 430 нм (ширина полосы 5 нм). Кроме того, излучение при 527 нм (ширина полосы 5 нм) было измерено при возбуждении на 477 нм (ширина полосы 5 нм). Остальные параметры были сохранены, как описано выше для измерений FRET. Для каждого условия готовили 4 повтора в 384-луночных планшетах с объемом 10 мкл на лунку.

Сравнение сигналов для конструкций FRET

Чтобы проверить сигнал rFRET различных конструкций TNKS ARC и SAM, 250 нМ CFP-слитый TNKS1-ARC1, -ARC2, -ARC2-3, -ARC3, -ARC4 или -ARC5 и TNKS2-ARC1, -ARC4 или -ARC5 смешивали с 500 нМ YFP-TBM.Аналогичным образом, 250 нМ белковых конструкций TNKS1 SAM (E1050K) -CFP или TNKS2 SAM (E897K) -CFP каждая была смешана с 500 нМ TNKS1 SAM (Y1073A) -YFP или TNKS2 SAM (Y920A) -YFP. 250 нМ родственных конструкций CFP, смешанных с 500 нМ YFP, использовали в качестве контроля. Для каждого условия готовили 4 повтора в 384-луночных планшетах с объемом 20 мкл на лунку.

Competition assay и измерения IC

CFP-TNKS2-ARC4 (100 нМ) и YFP-TBM (200 нМ) смешивали с возрастающими концентрациями немеченого ARC4.TNKS2 SAM (E897K) -CFP (150 нМ) и TNKS2 SAM (Y920A) -YFP (300 нМ) смешивали с возрастающими концентрациями немеченого SAM (Y920A). Для измерения значений IC ₅₀ для соединений 5,7-дихлоркинуреновой кислоты и Fanapanel, CFP-TNKS2-ARC4 (50 нМ) и YFP-TBM (100 нМ) смешивали с возрастающими концентрациями соединений. Кроме того, для статистического анализа контроли без немеченых белков или соединений и содержащие 1 M GdnHCl были установлены на 2 порядка величины от наименьшей и наибольшей концентраций смешанного белка или серий разведений соединения, соответственно.Анализ данных был проведен в GraphPad Prism 7 с использованием нелинейного регрессионного анализа (сигмоидальная подгонка доза-ответ с переменным наклоном). Для каждого условия готовили 4 повтора в 384-луночных планшетах с объемом 20 мкл на лунку.

Проверка сигнала анализа

Эксперименты проводились в 1536-луночных планшетах, и растворы переносились с использованием дозатора жидкости Mantis (Formulatrix). Для оценки концентраций конструкций, используемых для скрининга, тестировали сигнал FRET TNKS2 CFP-TNKS2-ARC4 и YFP-TBM, а также SAM (E897K) -CFP и TNKS2 SAM (Y920A) -YFP при возрастающих концентрациях пар ладов. .Отношение донора FRET к акцептору поддерживали постоянным на уровне 1: 2. Были протестированы концентрации доноров / акцепторов FRET 50/100, 100/200, 150/300, 200/400 и 250/500 нМ, и для каждого условия было собрано 48 точек данных. Объемы составляли 5 мкл на лунку.

Для расчета Zʹ-факторов ³⁹ , CFP-TNKS2-ARC4 (100 нМ) и YFP-TBM (200 нМ) или TNKS2 SAM (E897K) -CFP (150 нМ) и TNKS2 SAM (Y920A) — YFP (300 нМ) смешивали, и сигнал rFRET измеряли в присутствии и в отсутствие 1 М GdnHCl с 680 повторами для каждого условия.Объемы составляли 6 мкл на лунку.

Подтверждающий скрининг

Для скрининга 60 нл соединений из библиотеки Tocriscreen Mini (Tocris Bioscience) переносили в 1536-луночные планшеты. Смеси CFP-TNKS2-ARC4 (100 нМ) и YFP-TBM (200 нМ) или TNKS2 SAM (E897K) -CFP (150 нМ) и TNKS2 SAM (Y920A) -YFP (300 нМ) были приготовлены в буфере для анализа ( 10 мМ бис-трис-пропан pH 7,0, 3% (мас. / Об.) PEG20,000, 0,01% (об. / Об.) Triton-X100 и 0,5 мМ TCEP), и сигнал rFRET измеряли при двух длинах волн возбуждения: 410 нм и 430 нм. нм.Смеси белков переносили в планшеты с помощью дозатора жидкости Mantis (Formulatrix).

Дифференциальная сканирующая флуориметрия

Эксперименты проводили в аналитическом буфере (10 мМ бис-трис-пропан, pH 7,0, 3% (мас. / Об.) PEG20,000, 0,01% (об. / Об.) Triton-X100 и 0,5 мМ TCEP ) в 96-луночных планшетах для КПЦР. Немеченый TNKS2-ARC4 смешивали с красителем SYPRO Orange (ThermoFisher Scientific) до конечных концентраций 5 мкМ ARC4 и 5 × SYPRO Orange и объема 20 мкл. Для определения температуры плавления к смеси добавляли 100 мкМ 5,7-дихлоркинуреновой кислоты, Fanapanel или TBM-пептид (REAGDGEE, JPT Peptide Technologies).Кроме того, были приготовлены контроли, не содержащие соединений. Все условия содержали 1% (об. / Об.) ДМСО. Точки данных для кривых плавления записывали с интервалом в 1 мин в диапазоне 20–95 ° C, при этом температура увеличивалась на 1 ° C / мин. Анализ данных был выполнен в GraphPad Prism 7 с использованием нелинейного регрессионного анализа (сигмоидальное уравнение Больцмана) нормированных данных. Для каждого условия готовили 4 повтора с объемом 20 мкл на лунку.

Анализ репортера передачи сигналов Wnt

Линия клеток TCF / LEF reporter-HEK293 (rHEK293), содержащая анализ стабильно интегрированного репортера Wnt, была приобретена у BPS Bioscience, каталог № 60501.Анализ по существу выполняли, как описано ранее ⁴⁷ с небольшими изменениями. Вскоре вместо бессывороточной среды использовали 1 мМ Na-пируват (Gibco) и 10% фетальную бычью сыворотку, содержащую среду DMEM. Соединения (DCKA, Fanapanel, XAV939) напрямую переносили на аналитические планшеты с помощью акустического дозатора Echo 650. Клетки инкубировали с соединениями в течение 20 ч перед добавлением контрольных сред и сред, кондиционированных Wnt3a. Все условия содержали 0,5% (об. / Об.) ДМСО.

лад — WordReference.com Словарь английского языка

Страница ошибки | Идеальный Интернет-магазин

 Чтобы продолжить, выберите хотя бы один проект.

Пожалуйста, выберите рабочее место, чтобы выбрать все связанные проекты. {{если projectsData.maxWorksites! = null}} Вы можете выбрать до {{: projectsData.maxWorksites}} сайтов. {{/если}}

Показаны рабочие сайты {{: projectsData.worksites.length}}

Отображение рабочие места

Расширить все | Свернуть все

Отступление

Истекает

Потребление

{{:кодовое название}}

Истекает: {{:истекает}} {{if expiresIn> 1}} дней {{/если}} {{if expiresIn == 1}} День {{/если}}

Расход:

Нет максимальной суммы

Необходимо выбрать хотя бы один проект

Сохранить

Выберите хотя бы один проект

Необходимо выбрать хотя бы один проект

Другое слово для FRET> Синонимы и антонимы

1. лад

глагол. [‘ˈfrɛt’] беспокоиться излишне или чрезмерно.

• болтовня
• дизеринг
• сомнение
• беспокойство
• беспокойство
• лоскут

• дурной характер
• зловредность
• неловкость
• 11 естественный объект
• фретан (древнеанглийский (ок.450-1100))
• fretum (латиница)

Слова, рифмующиеся с ладом

• кабриолет
• суфражетта
• sobriquet
• minuet
• luncheonet
• lavioet 9037
• кларнет
• Calumet
• Антуанетта
• Willamette
• тагамет
• статуэтка
• slushayete
• силуэт
• секстет
• квинтет
• квартет
• Пиночет
• Nicolette
• Nicolet
• лорнет
• Ларрокетт
• кухня
• intermet
• henriette
• cullinet

Примеры предложений слова fret

1. Глагол, не в единственном числе от третьего лица
Некоторые родители беспокоятся , что их подростки могут не захотеть видеть их в университетском городке.

2. Глагол, основная форма
Если вы никогда особо не тренировались, не волнуйтесь о : это не безнадежное дело.

3. Существительное, единственное число или масса
Поднимитесь по грифу, играя каждую ноту на следующем ладу , пока не найдете мертвый лад.