Форд сиерра косворт: KUNST! Как приставка Cosworth сделала из обычных Ford грозное оружие — ДРАЙВ

Просмотров: 1 707

И это лишь несколько самых очевидных моментов. А сколько еще скрыто внутри… Горячие хэтчбеки Ford популярны во всем мире и достаточно давно. В этом году Ford Focus RS 2017 модельного года стал абсолютно глобальным автомобилем, поставляющимся на все рынки, где продается Ford. В честь этого события давайте вспомним все автомобили, которые создали вселенную RS.

1968 Ford 15M RS Coupe

Хоть индекс RS получит широкое распространение только после выпуска построенных в Британии Escort RS, Escort Mexico и Capri RS, история RS фактически начинается в Германии. Именно там были построены три автомобиля RS (Rally Sport). С двигателем V4 и передним приводом, модель 15М послужила базой для первой версии RS в 1968 году.

1969 Ford 17M RS

Немного более крупный Ford 17M также получил версию RS. Находясь между моделями 15М и 22М он получил построенный в Кельне 2.0 литровый двигатель V6 и привод на задние колеса.

1969 Ford 20M RS

Ford 20M – люксовая версия 17М – также не обошелся без шильдика RS. Под капотом у него был 2.3 литровый V6.

1970 Ford Escort RS1600

Большинство поклонников RS считают именно этот Escort RS1600 истинным родоначальником серии. Оснащенный 1.6 литровым четырехцилиндровым двигателем Cosworth, это был один из первых серийных автомобилей с системой четырех клапанов на цилиндр (на фото модель 1971 года).

1970 Ford Capri RS2600

Дебютировавший в 1970 году на автосалоне в Швейцарии, Capri RS2600 был произведен всего в количестве 50 экземпляров в соответствии с требованиями омологации. Производство серийной версии RS2600 началось позднее в том же году и это был первый европейский автомобиль Ford, использующий систему впрыска топлива. В 1971 году Ford начал продавать серийные Capri в США под маркой Mercury Capri.

1970 Ford Escort Mexico

Созданный под впечатлением от раллийного автомобиля на базе Escort, за рулем которого гонщик Ханну Миккола выиграл гонку London to Mexico World Cup Rally 1970 года, Escort Mexico имел под капотом проверенный 1598 кубовый двигатель Kent с верхним расположением клапанов вместо 16-клапанного Cosworth (как у RS1600). Производство было налажено на сборочном предприятии Ford в Эссексе, Англия.

1973 Ford Capri RS3100

В 1973 году Ford выпустил Capri RS3100. Оснащался он выпускавшимся в Эссексе двигателем V6 и был выпущен ограниченной серией в 250 экземпляров.

1973 Ford Escort RS2000

Escort RS2000 также явился публике в 1973 году. Четырехцилиндровый 2.0 литровый надежный двигатель «Pinto» Ford, был вполне достойной альтернативой темпераментному двигателю RS1600.

1975 Ford Escort RS1800

Производство Escort Mark I закончилось в декабре 1974 года, а вышедшее следующее поколение – Mark II – сразу же получил RS версию в виде 115 сильного RS1800 (на фото – гоночный автомобиль).

1975 Ford Escort RS Mexico

Ford Escort RS Mexico вышел в серию также в 1975 году. Он стал более миролюбивой альтернативой агрессивному RS2000, который вышел позднее.

1976 Ford Escort RS2000

Вскоре после выхода RS1800 1975 модельного года, Форд запустил Escort RS2000 с 2,0-литровым двигателем SOHC с четырьмя цилиндрами и 110 л/с. (на фото модель 1978 года).

Ford Escort RS1700T

В конце 1980 года Ford выпустил прототип Escort RS1700T. Как вы, наверное, уже догадались, T – это турбо. Турбина устанавливалась на 1.7 литровый четырехцилиндровый двигатель Ford. Проект был закрыт после выпуска 17 экземпляров, отчасти из-за появления в ралли полного привода, отчасти – из-за трудностей с дальнейшими разработками.

1981 Ford Capri RS2.8 Turbo

В 1981 году все-таки решили вернуться к турбированной версии показали Capri Turbo. Турбина устанавливалась на 2.8 литровый V6 Ford, благодаря чему мощность увеличивалась до 187 сил. Серия была ограничена 200 экземплярами.

1982 Ford Escort RS1600i

Анонсированный осенью 1981 года, «леворукий» 115 сильный Escort RS1600i поступил в продажу вскоре после презентации. Праворульные автомобили начали продаваться в Британии весной 1982 года. Особенностью этого автомобиля были электрические стеклоподъемники и центральный замок.

1984 Ford Escort RS Turbo

Появившийся в конце 1984 года Escort RS Turbo с 1.6 литровым турбированным двигателем, был оборудован дифференциалом LSD для оптимизации распределения крутящего момента. По заявлению Ford, это был первый переднеприводный автомобиль с такой технологией.

Ford RS200

Один из самых безбашенных автомобилей, которые когда-либо носили шильдик RS. RS200 был сделан среднемоторным и полноприводным, специально для участия в знаменитой Группе В ралли. Всего 200 автомобилей были построены в период с 1983 по 1985 год для того, чтобы быть допущенными до участия в группе. Однако в 1986 году Группа В была закрыта из-за смерти гонщика. Гоночные версии планировалось «раскачать» до 450 л/с, но и обычные версии, оснащенные 1.8 литровыми двигателями, продолжали неплохо конкурировать в ралли следующие несколько лет.

1986 Ford Sierra RS Cosworth

2.0 литровый инжекторный, турбированный четырехцилиндровый двигатель выдавал 200 л/с давал возможность автомобилю отлично разгоняться, а в остальном инженеры уделили особое внимание аэродинамике для лучшей управляемости и стабильности на дороге на больших скоростях.

1986 Ford Escort RS Turbo

RS Turbo продолжал производиться весь 1986 год, получив обновления нового поколения Escort, а также механические и ходовые доработки, которые позволяли ему отлично управляться на дорогах.

1987 Ford Sierra RS500 Cosworth

Sierra RS500 Cosworth сменил в 1987 году Sierra RS Cosworth предыдущего модельного года. Мощность 2.0 литрового турбированного четырехцилиндрового двигателя была около 220 л/с.

1988 Ford Sierra RS Cosworth

В 1988 году Ford представил седан Sierra RS Cosworth, который на некоторых рынках звали Sapphire (на фото модель 1991 года).

1990 Ford Sierra RS Cosworth 4×4

В 1990 году стала доступна полноприводная версия седана Sierra Cosworth/Sapphire

1990 Ford Fiesta RS Turbo

Fiesta получила RS версию в 1990 году. Крошка обрела 1.6 литровый четырехцилиндровый турбированный двигатель в 130 л/с.

1991 Ford Escort RS2000

В 1991 году в продажу поступил Escort RS2000 с атмосферной 2.0 литровой «четверкой».

1992 Ford Escort RS Cosworth

Оснащенный самыми современными на тот момент полноприводными технологиями Ford, Escort RS Cosworth получил 227 сильную 2.0 литровую турбочетверку и непропорционально большой задний спойлер.

1992 Ford Fiesta RS1800

В 1992 году в Fiesta RS1800 заменили турбированный двигатель на атмосферный 1.8 четырехцилиндровый, который выдавал примерно такую же мощность.

1993 Ford Escort RS2000

Производившийся с 1993 до конца 1995 года Escort RS2000 получил полный привод и дисковые тормоза. Когда год спустя закончилось производство Escort Cosworth, производство автомобилей RS приостановилось на долгие 5 лет.

2002 Ford Focus RS

Изначально показанное в виде концепта на Женевском автосалоне 1998 года, первое поколение Focus RS дебютировало в серийной версии на Женевском автосалоне в 2001 году. Автомобили начали выезжать с конвейера в 2002 году, ознаменовав возвращение RS серии. Несмотря на то, что Ford показал концепт Fiesta RS в 2004 году, значок RS появился в следующий раз только на Focus RS в 2009 году.

2009 Ford Focus RS

В 2009 году Focus RS вернулся уже с 300 сильным турбированным 2.5 литровым рядным пятицилиндровым двигателем. У него была инновационная передняя подвеска RevoKnuckle, которая отлично укрощала высокую мощность двигателя и позволяла не оказаться в ближайшей канаве при резком ускорении.

2010 Ford Focus RS500

В 2010 году вышла ограниченная серия с 345 сильным двигателем и агрессивным дизайном. Все 500 экземпляров разошлись крайне быстро.

2017 Ford Focus RS

Для размышления: 315 л/с, полный привод третьего поколения. 2.3 литровый EcoBoost, который устанавливается в Mustang. Его одобрил сам Кен Блок, испытав в очередной Джимхане. Нормально? Надо брать.

Запрашиваемая страница не найдена!

Категории …Коллекционные моделиИнструментКраска, химия, материалыМаскиКаталоги, Книги, ЖурналыСборные моделиФототравлениеБоксы и стеллажи Журнальные серииИгрушкиРадиоуправляемые моделиСувенирыConcept CarАвтоспортАэродромная техникаВоенныеКиноМедицинаПожарныеПолицияПочта / mailСпецслужбыСтроительная техникаТакси

Производители …78artAA ModelsAberAbordageAbrexAbteilung502AcademyACEACMEAdvanced ModelingAFV clubAGM ModelsAHC ModelsAIM Fan ModelAiresAirFixAK InteractiveAKhobbyAlanAlangerAlclad IIAlex MiniaturesAlezanAlfAlmostrealALRAltayaAmercomAmerican DioramaAmerican Heritage ModelsAMG ModelsAMKAMMO MIGAmodelAmourAMPAMTAmusing HobbyAnsonAoshima (DISM)Apex RacingARK modelsARM. PNTArmada HobbyArmaHobbyArmoryARS ModelArt ModelART-modelAscensioASK ModelsASQATCAtlasAudi MuseumAurora HobbyAuthentic DecalsAuto PilenAutoArtAutobahnautocultAutomodelle AMWAutomodelloAutotimeAutoworldAvanstyle (Frontiart)Avart ArhiveAVD ModelsAVD дополненияAVD покрышкиAvisAWMAZModelBachmannBalaton ModellBangBare-Metal Foil Co.BauerBBRBburagoBegemotBest ModelBest of ShowBianteBingBizarreBM CreationsBM-ToysBobcat dealerBorder ModelBrekinaBroncoBrooklin ModelsBrummBS DesignBuschby AKBy VolkCaesar miniaturesCar BadgeCararama (Hongwell)CarlineCarNelCBModelsCentauriaCenturyCentury DragonCentury WingsCHIEFF ModelsChina ModelsClassic 43ClassicbusClearPropCMCCMFCMKCMRColibri DecalsCollector’s ClassicsConradCopper State ModelsCorgiCrazy Classic TeamCult Scale ModelsCursorD.N.K.Daimler-MARDANmodelsDarksideDasModelDAYdiecastETCHDays-goneDeAgostiniDecal ShopDel PradoDenisssModelsDetailCarsDiapetDickie SpielzeugDie-Cast superDie-cast по-домашнемуDifferent ScalesDinky ToysDiOlex ProductionDioparkDioramaTechDiP ModelsDirekt CollectionsDistlerDMA Hue StudioDNAdnanoDoctor DecalDong GuanDorlopDragonDUPLI COLOREaglemossEasy ModelEbbroEco-Wood-ArtEdison GiocattoliEdmon StudioEduardEidolon Make-UpELFEligorEmanEMC ModelsERAERTLESCIEsval ModelsEUREKA XXLEvergreen (USA)EVR-miniExcelExotoEXPRESSO WINGSFalcon ModelsFallerFine MoldsFirst 43 ModelsFirst ResponseFirst to FightFLAGMANFlyFly Car ModelFlyHawk ModelForces of ValorFormat72Forward-68FoxtoysFranklin MintFreedom ModelsFriulmodelFrontiartFUGU_GARAGEFujimi MokeiGAMAGarageGarbuz modelsGartexGearboxGeminiJetsGems & CobwebsGIMGK Racer SeriesGlencoe modelsGLMGMP / ACMEGMU ModelGoldvargGorky ModelsGreat Wall HobbyGreenlightGroup MastersGT AutosGT SpiritGuiloyGuisvalGunTower ModelsHachetteHarder_SteenbeckHartoy Inc. HasbroHasegawaHat Plastic ModelsHedgeModelsHekiHellerHerpaHi-StoryHigh SpeedHighway 61HistoricHobby 2000Hobby BossHobby DesignHobby MasterHobby PlanetHobbyCraftHomerHot WheelsHot Wheels EliteHPIHumbroli-ScaleIBG ModelsICMICV (СПб)IlarioInno ModelsInterusISTItaleriIVYIXOJ-CollectionJada ToysJadiJASJB ModellautosJoalJohn Day ModelsJohnny LightningJolly ModelJouef EvolutionJoy CityJTKKadenKangnamKatoKAV modelsKeng Fai ToysKESS ModelKineticKing starKinsmartKitechKitty HawkKK ScaleKorean modelsKOVAPKovozavody ProstejovKremlin Vehicle parkKV ModelsKyoshoK_S Precision MetalsLa Mini MinieraLada ImageLastochkaLCD MODELSLenmodeLLeo ModelsLIFE in SCALELion-ToysLionRoarLiveResinLledoLooksmartLouis SurberLS CollectiblesLucky DiecastLucky ModelsLucky PlanLUSO-toysLuxcarLuxury CollectiblesLuxury die-castM-SmartM2 MachinesM4 MAC DistributionMacadamMACHETEMagic ModelsMaistoMake UpMAKSIPROFMaquetteMarklinMARSMars ModelsMarsh ModelsMaster BoxMaster ToolsMasterClubMasterCraftMatchboxMatrixMax-ModelsMaxi CarMAXI COLORMaxichampsMaxModelsMD-modelsMengMercuryMeritMetroMicro Scale DesignMIG productionsMilestone MiniaturesMilitaryWheelsMini GTMiniarmMiniArtMiniaturmodelleMinichampsMiniClassicMinicraftMiniCraft Scale ModelsMiniHobbyModelsMiniTankMiniWarPaintMIRAMirage HobbyMirror-modelsMISTERCRAFTMMPModel PointModel-IconsModelCarGroupModelcollectModelerModelGunModelProModelSvitModimioMODUS 90MolotowMondo MotorsMondseeMonogramMONTI SYSTEMMoonMoremMotipMotor MaxMotoramaMotorartMotorheadMotoScaleModelsMPCMPMMR CollectionMr. HobbyMTech (M4)Nacoral S.A.NEONeomegaNew PenguinNew RayNH DetailNickelNik-ModelsNittoNochnonameNorevNorscotNorth Star ModelsNostalgieNVANZG ModelleOKB GrigorovOld CarsOLFAOlimp ModelsOne by One ProductionONYXOrionORNST modelOTTO ModelleOvs-DecalsOxfordPacific88Palma43Panda HobbyPaniniPANTHEONPanzerstahlParagonPasDecalsPasModelsPaudi ModelsPB Scale ModelsPegas-ModelsPegoPhoenix MintPinKoPlatzPlusmodelPMSPorsche MuseumPotato CarPremium ClassiXXsPremium Scale ModelsPremium XPrint ScaleProDecalsProgetto KPrommodel43Provence MoulagePSTPt ModelsQuartzoQuickboostQuinta StudioRacing Champions inc.RAROGRastarRB ModelRBA CollectiblesRebel CustomRecord — M.R.F.Red BoxRed LineRenn MiniaturesRenner WerbemittelReplicarsResKitRevellRextoysREXxRickoriddikRietzeRiichRiich ModelsRIORMZ CityRoad ChampsRoad KingsRob-TaurusRodenROSRossoRosso & FlyRoubloffRPG-modelRPMRTMRusAirRussian collectionRye Field ModelS-ModelSaicoSC Johnson (USA)ScaleGarageSchabakSchucoSEAT (дилер.)SG-ModellingShelby CollectiblesShurikenSignatureSIKUSkale WingsSKIFSky-HighSmerSMMSnakeModelSochi 2014SolidoSophiArtSouth FrontSOVA-MSoviet ArmourSparkSpecial HobbyStarlineStart Scale ModelsSTC STARTSTMSunnysideSunstarSuper ASX-ArtS_BT-ModelT. R.L. ModelTakomTameo KITsTamiya (J)TarmacTech4TecnomodelTeknoThunder ModelTic TocTiger ModelTin WizardTins’ ToysTMTmodelsTOGATomicaTop MarquesTop Model CollectionTopSpeedToxso ModelTraxTriple 9 CollectionTristarTrofeuTrumpeterTSM ModelUCC CoffeeUltimate DiecastULTRA modelsUM Military TechnicsUM43UMIUnimaxUniversal HobbiesunoMAGUT ModelsV.V.M / V.M.M.V43Vallejovanamingo-nnVanboVanguardsVAPSVector-ModelsVeremVictoriaVintage Motor BrandsVIPcarVitesseVM modelsVMmodelsVmodelsVoka-ГРАНЬVrudikWar MasterWasanWaterlooWeiseWellyWhite BoxWhite RoseWikingWilderWingsyWinModelsWIX CollectiblesWM KITWSIXQ Xuntong ModelYat MingYVS-ModelsZ-ModelsZebranoZedvalZip-maketZISSZZ ModellаRтБаZаАвто-бюроАвтоисторияАвтопанорамаАвтопаркАГАТАиФАканАМформаАнтонюкАрсеналартель УниверсалъАтелье Etch modelsАтомБурБеркутБригадирВекторВитязьВойны и битвыВосточный экспрессГараж на столеДекали BossДекали ModelLuxДекали SF-AutoДилерские модели БЕЛАЗДругойЗвездаИмпериалъКазанская лабораторияКиммерияКОБРАКолхоZZ DivisionКомбригКомпаньонЛитература (книги)ЛОМО-АВМмастер DimscaleМастер Дровишкинмастер КолёсовМастер СкаляровМастерПигментМастерская Decordмастерская JRМастерская SECМастерская АВТОДОРМастерская ГоСТМастерская ЗнакМастерская КИТМастерская МЕЛМаэстро-моделсМикродизайнМикроМирМиниградМинимирМир МоделейМодел. лабМОДЕЛИСТМоделстройМодельхимпродуктМР СТУДИЯНаш АвтопромНаши ГрузовикиНаши ТанкиОгонекПАО КАМАЗПетроградъПетроградъ и S_BПламенный моторПланета ПатворковПобедаПрапорПрестиж КоллекцияПромтракторРетроЛабРусская миниатюраРучная работаСарлабСВ-МодельСделано в СССРСергеевСМУ-23.SСоветский автобусСолдатикиСПБМСТАРТ 43Студия МАЛТАРАНТемэксТехнологТехноПаркТри А СтудиоТри БогатыряТРЭКСХерсон МоделсЦейхгаузЧЕТРАЭлеконЭскадраЮный коллекционерЯ-Моделист

Марки моделей …AbarthACAcuraADLERAECAGUSTAWESTLANDALFA ROMEOALPHA TAURIALPINE ALVISAMCAMERICAN LaFranceAMPHICARArmstrongAROArrowsARTEGAASCARIASTON MARTINAUBURNAUDIAURUSAUSTINAustro DaimlerAUTO UNION AutobianchiAVIAAWZBACBARKASBATMOBILEBEDFORDBEIJINGBenelliBENETTONBENTLEYBERLIETBERNARDBESTURNBIANCHIBIZZARINIBLUEBIRDBMWBobcatBORGWARDBRABHAMBrawner-HawkBRISTOLBRMBUCCIALIBUFFALOBUGATTIBUICKBussingBWTCADILLACCAPAROCASECATERHAMChanganChangheCHAPARRALCHAUSSONCHECKERCHEETAHCHEVROLETCHRYSLERCISITALIACITROENCOBRACOMMERCooperCOPERSUCARCORDCORVETTE CORVIAR MONZACsepelDACIADaewooDAFDAIHATSUDAIMLERDALLARADATSUNDE DION BOUTONDe SotoDE TOMASODELAGEDELAHAYEDeLOREANDENNISDESOTODEUTZ DIAMONDDKWDODGEDongfengDONKERVOORTDUBONNETDUCATIDUESENBERGDYNAPACEAGLEEBROEDSELEMWENVISIONFACEL-VEGAFAWFENDTFERRARIFIATFORDFORDSONFOTONFRAMOFREIGHTLINERFSOGINAFGMCGOGGOMOBILGOLIATHGORDONGRAHAMGREAT WALLGUMPERTHAMMHANOMAGHARLEY DAVIDSONHEALEYHENSCHELHindustan HINOHISPANO SUIZAHITACHIHOLDENHONDAHORCHHOTCHKISSHUDSONHUMBERHUMMERHYUNDAIIFAIKARUSIMPERIALINFINITIINGINNOCENTIINTERNATIONALINVICTAIRISBUSISOISOTTA FraschiniISUZUIVECOJAGUARJAWAJEEPJELCZJENSENKAISERKalmarKAWASAKIKENWORTHKIAKOENIGSEGG KOMATSUKRAMERKRUPPKTMLA SALLELAGONDALAMBORGHINILANCIALAND ROVERLANDINILanzLatilLaurin & KlementLaverdaLDSLEXUSLEYATLEYLANDLEYTONLIAZLIEBHERRLIGIERLINCOLNLISTERLLOYDLOCOMOBILELOLALORENZ & RANKLLORRAINE-DIETRICHLOTECLOTUSLUBLINMACKMAD MAXMAGIRUSMANMARCHMARUSSIA-VIRGINMASERATIMASSEY MATRAMAXIMMAYBACHMAZDAMAZZANTIMCAMcLARENMEGAMELKUSMERCEDES-BENZMERCERMERCURYMESSERSCHMITTMGBMIGMIKRUSMINARDIMINERVAMINIMIRAGEMITSUBISHIMONICAMORETTIMORGANMORRISMOTO GUZZIMULTICARMVMZNASH AMBASSADORNEOPLANNEW HOLLANDNISSANNIVA CHEVROLETNOBLENORMANSUNYSAOLDSMOBILE OLTCITOM LEONCINOOPELOPTIMASORECAOscaPACKARDPAGANIPanhardPANOZPANTHERPEGASOPESCAROLOPETERBILTPEUGEOTPHANOMEN PIERCE ArrowPLYMOUTHPOLONEZPONTIACPORSCHEPRAGAPRIMAPRINCE PUMARAMRAMBLERRED BULLRENAULTRoburROCARROLLS-ROYCEROSENBAUERROSENGARTROVERRUFSAABSACHSENRINGSALEENSALMSONSAMSUNGSANSANDEROSATURNSAUBERSaurerSAVASAVIEM SCAMMELSCANIASCIONScuderiaSEAGRAVESEATSETRASHADOWSHANGHAISHELBYSIMCASIMPLEXSIMSONSINPARSKODASMARTSOMUASoueastSPYKERSSANG YONGSSCSTANLEYSTARSTEYRSTUDEBAKERSTUTZSUBARUSUNBEAMSUZUKISYRENATALBOTTARPANTATATATRATEMPOTeslaTHOMASTOYOACETOYOPETTOYOTATRABANT TRIUMPHTUCKERTUKTVRTYRRELLUNICVANWALLVAUXHALLVECTORVELOREXVENTURIVERITASVESPAVincentVOISINVOLKSWAGENVOLVOWANDERERWARSZAWAWARTBURGWESTERN STARWHITEWIESMANNWILLEMEWILLIAMSWillysYAMAHAYOSHIMURAYUGOZAGATOZASTAVAZUKZUNDAPPZunderZYTEKАМОБЕЛАЗВИСВНИИТЭ-ПТВолжский автомобильГорькийЕрАЗЗАЗЗИLЗИSЗИМЗИУИЖКАЗКамский грузовикКИМКРАЗКубаньКурганский автобусЛАЗЛенинградЛикинский автобусЛуаЗМАЗМЗКТМоАЗМОСКВИЧМТБМТЗНАМИНАТИОДАЗПавловский автобусПЕТРОВИЧРАФРуссобалтСаранский самосвалСемАРСМЗСТАРТТАРТУУАЗУралЗИСУральский грузовикЧЕТРАЧМЗАПЯАЗЯТБ

Типы товаров . ..ДекалиЗапчасти, аксессуарыЭлементы диорамАвиацияВоенная техникаВодный транспортЖ/Д транспортАвтобусВнедорожник / КроссоверГрузовикКемперГужевая повозкаЛегковой автомобильМикроавтобус / ФургонМотоциклПикапПрицепыТракторы, комбайныТроллейбусФигурки

Масштаб …1:11:21:31:51:61:81:91:101:121:141:161:181:201:211:221:241:251:261:271:281:291:301:321:331:341:351:361:371:381:391:401:421:431:441:451:461:471:481:501:511:521:541:561:571:601:641:681:691:721:751:761:801:831:871:901:951:961:1001:1031:1081:1101:1121:1201:1211:1251:1261:1301:1421:1441:1451:1481:1501:1601:2001:2201:2251:2501:2851:2881:3001:3501:3901:4001:4501:5001:5301:5501:5701:6001:7001:7201:8001:10001:11001:12001:12501:15001:2700

Такой Ford Sierra увидишь не каждый день

В наше поле зрения попал отреставрированный экземпляр Ford Sierra ее последней версии — Mk. III. Владелец машины Михаил согласился поподробнее рассказать нам о процессе восстановления и опыте владения этим автомобилем. «Любовь к Sierra у меня, считай, с детства, — объясняет молодой человек. — Мне было лет восемь, когда я впервые увидел такую машину. Причем не обычную версию, а редкую модификацию Cosworth, которая в то время еще была вполне себе новинкой. Весьма и весьма редкий зверь, особенно в СНГ. С того момента данная модель стала занимать особое место в моем сердце».

Для начала

«Через пару лет после моего знакомства с Cosworth мой отец приобрел себе Sierra и ездил на ней практически без нареканий около десяти лет, — вспоминает автовладелец. — Учитывая все это, неудивительно, что, повзрослев, я захотел себе такой же автомобиль. Первая попытка восстановления, правда, не увенчалась успехом, поскольку экземпляр там был совсем дохлый. Зато на своей нынешней Sierra я езжу уже семь лет и останавливаться не собираюсь».

В Беларусь этот Ford 1992 года выпуска ехал через Москву из Бельгии. До Михаила у него было еще двое хозяев, но лишь первый владел машиной на протяжении долгого времени: «Достаточно почтенного возраста человек, автомобилем особо не пользовался. Он продал Sierra парню, у которого она побыла буквально год или два, после чего появился я. Всего $1000 — и машина моя».

Что, откуда, сколько?

Главной установкой нового владельца стала аутентичность вплоть до мелочей. Михаил старался приобретать только оригинальные детали, что в наших реалиях оказалось не так-то просто сделать. Что-то пришлось искать в Польше, России, Германии, Англии, Турции, Украине. «Те детали, которые можно найти в Беларуси, мягко говоря, не очень качественны, — откровенно говорит реставратор. — К тому же цены на них завышены просто невероятно. Почему так? Потому что белорусские продавцы хотят наварить на якобы дефицитных запчастях, хотя в Европе или в той же России эти самые запчасти имеют абсолютно адекватную стоимость. Бывает и так, что за условный клапан холостого хода просят $60, но при этом такого клапана даже нет в наличии».

Обвес Михаил поставил классический, RS. Именно такой вариант и предлагался для Sierra Mk. III. Практически все его элементы, за исключением передних (их привезли из Германии), удалось найти в Польше, а цена вопроса с учетом покраски и установки составила около $500. Редкий спойлер Cosworth нашелся в Могилеве за $100. По словам владельца, таких спойлеров в Беларуси всего штук пять. Руль приехал из Англии за $250. Фальшрешетка была куплена в России за $40. Из Турции привозились различные мелкие запчасти. Приборную панель делали на заказ украинские мастера.

Оригинальный задний диван (велюр в сочетании с кожей) шел в комплекте с сиденьями Recaro Comfort, которые со временем Михаил заменил на Recaro Sport, снятые, однако, с Opel. Свой выбор автомобилист мотивирует тем, что материал у этих сидений прочнее, нежели у найденных им версий для Ford (в то время компания Recaro производила практически идентичные сиденья для нескольких марок, в числе которых были и Ford с Opel). Цена — в районе $250. Перетяжку салона Михаил сделал своими руками, потратив около $100. Капот с «жабрами», как признается хозяин, — это подарок на день рождения.

«Все дело в том, что один человек продавал Sierra, — поясняет владелец. — Мне нужен был лишь капот. Целый год звонил, упрашивал — он ни в какую. Я уже и свой капот в дополнение к деньгам предлагал, готов был даже установить его и подогнать по цвету. Но все равно слышал „нет“. Решил попытать счастья в свой день рождения. И повезло! С учетом обмена капотами я отдал $150. А с дисками история была даже более интересной. Их я года три разыскивал по всяким барахолкам. Искал конкретно Centra R17 — такие ставились, например, на поздние Scorpio. Лично для меня эти диски идеально соответствуют Sierra. Есть, конечно, и другие достойные варианты, но этот ничто не переплюнет, на мой взгляд. В итоге я эти диски нашел в Бресте, они были для Audi. Купил за $270 и начал пескоструить, потому что состояние было аховое. Пескоструил, шпаклевал, грунтовал, красил… Прибавить к этому покупку резины, и конечная цена выйдет в районе $1000. Уже шесть лет прошло, всякие царапины на дисках снова появляются, но по сравнению с тем, что было изначально, это ерунда».

Восьмиклапанный двигатель объемом 2 литра, который был установлен изначально, Михаил заменил на такой же, только 16-клапанный. Мотор взят с Ford Scorpio, его мощность составляет около 155 л. с., а пробег на момент приобретения был в районе 130 тыс. км. Текущий пробег — около 190 тыс. км. Автомобилем молодой человек пользуется постоянно, ставя его в гараж лишь в холодные и снежные зимы. Максимальная скорость, которой удалось достичь нынешнему владельцу Sierra на ровной дороге, — 210 км/ч. Все вместе: покупка, переборка, установка, подключение двигателя — обошлось в $1100. «Изначально с мотором возился не я, но после взялся за него самостоятельно, — уточняет хозяин. — Просто мне не очень понравилось, как сделали сторонние мастера: все гремело, стучало, шумело. Решил сам „откапиталить“, приобретал только проверенные детали либо сделанные на заказ».

Будущее проекта

Все восстановительные работы Михаил старался проводить сам. «Тут сказался мой неудачный опыт с покраской, — вспоминает он. — Мне ребята в мастерской так все описали, что я думал, мол, за $1500 будет качественный результат. Но там просто загрунтовали, зашпаклевали, облили — и готово. Я же ожидал пескоструйной обработки, трех слоев грунта, двух слоев краски, двух слоев лака… Короче, пришлось устроиться к ним туда на работу. Вместе с ежедневными обязанностями занимался своей Sierra.

По кузову практически ничего не менял. В своем нынешнем виде автомобиль впервые выехал на дорогу в 2018 году. Сколько я сюда вложил, не знаю. Особо не считал, да и без надобности. Я прекрасно понимаю, что вложенные в машину деньги ко мне не вернутся. Занимался восстановлением Ford для себя, для души. Нужно действительно гореть этим, иначе ничего не получится. Ну и еще нужно быть немного сумасшедшим. Результатом я доволен, хотя всегда есть что доработать. Например, думаю ускорить мотор — поставить кованые поршни, турбину, спортивные „мозги“. Хочу задний бампер заменить, потому что мне его поцарапали в первый же день после того, как поставил. Жутко обидно. Вообще, пластик на задних бамперах у автомобилей Ford — это бич просто, хрупкий словно стекло. Передние сиденья планирую сделать в тон заднему дивану. Они ведь не с одной и той же машины взяты, есть разница в цвете. Можно перетянуть потолок. В остальном по салону все, в принципе, имеется: электрозеркала, электростеклоподъемники, электролюк… Для полного кайфа не хватает разве что кондиционера и подогрева лобового стекла. Но это редкие и дорогие вещи, которые так просто не поставишь».

Ничто не идеально

В качестве слабых моментов Михаил выделяет датчики и сайлент-блоки. Сам он поставил себе сделанные на заказ полиуретановые. «Гарантия — 50 тыс. км, — делится владелец Sierra. — Я езжу не так уж много, поэтому мне хватает. То, что продается у нас, — полная ерунда. Якобы оригинальные сайлент-блоки прослужат километров 40, а якобы усиленные аналоги — 2000 км. Больше особых проблем при эксплуатации автомобиля не возникает. Подвеска неприхотливая, перебирать ее часто не надо. Что касается коррозии, то я за машиной в этом плане стараюсь следить. Тем более что и работаю в этой сфере — занимаюсь полировкой, химчисткой и детейлингом автомобилей вместе с ребятами из GlobalClean. Хотя, безусловно, свою десятилетнюю гарантию кузов моей Sierra уже давно пережил. Со временем нужно все больше внимания уделять его поддержанию в надлежащем виде».

Auto.Onliner в Telegram: обстановка на дорогах и только самые важные новости

Есть о чем рассказать? Пишите в наш телеграм-бот. Это анонимно и быстро

Перепечатка текста и фотографий Onliner без разрешения редакции запрещена. [email protected]

Ford Sierra 2.0 RS Cosworth Технические характеристики, расход топлива

1-й федеральный кредитный союз сообщества

1-й федеральный кредитный союз сообщества предлагает вам возможность заполнить документы и получить финансирование через 1-е сообщество в представительстве.

Ниже приведен список дилерских центров, с которыми 1st Community работает в рамках этой программы.Мы не поддерживаем каких-либо дилеров, перечисленных ниже, и не предоставляем никаких явных или подразумеваемых гарантий на любую транзакцию или покупку в одном из перечисленных дилерских центров.

Мы рекомендуем вам сначала пройти предварительное одобрение в кредитном союзе, а затем делать покупки для получения более выгодной сделки. Предварительное одобрение позволяет:

1. Сэкономьте время в автосалоне
2. Дает вам возможность торговать наличными
3. Позволяет узнать процентную ставку и потенциальный ежемесячный платеж
4. Позволяет узнать максимальную сумму покупки, которую вы можете сделать

Форд Сьерра Седан 2.0i (125 Cv)

1. FORD
2. FORD SIERRA SEDAN 2.0I (125 CV)

ТЕХНИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ FORD SIERRA SEDAN 2.0I (125 CV)

ВОПРОСЫ И СОМНЕНИЯ ПО FORD SIERRA SEDAN 2.0I (125 л.с.)

Ford Sierra Sedan 2.0i (125 CV) имеет расход топлива:

• Комбинированный расход: 8,4 л / 100 км | 28 миль на галлон США | 33,63 миль на галлон в Великобритании

Ford Sierra Sedan 2.0i (125 Cv) имеет мощность 125 л.с. при 5500 об / мин

Sierra имеет крутящий момент 177 Нм при 2500 об / мин | 130,55 фунт-фут. @ 2500 об / мин

Ford Sierra Sedan 2.0i (125 Cv) развивает максимальную скорость 121,17 миль / ч (195 км / ч)

Sierra имеет общий вес 1200 кг (2645.55 фунтов)

Размеры шин этого автомобиля Ford: 185/60 R14

Размер колес этой модели Ford: R14

Запас топлива Sierra составляет 60 литров. (15,85 галлона)

Sierra имеет автоматическую коробку передач , 5 скоростей

ТЕХНИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОДОБНЫХ ТРАНСПОРТНЫХ СРЕДСТВ

Официальное уведомление | Уведомление о конфиденциальности | Файлы cookie

Copyright © 2021 FichasMotor

Ford Mondeo официально снят с производства, производство заканчивается в марте 2022 года

После того, как Ford в прошлом году прекратил производство американского автомобиля Fusion, его европейский брат постигнет та же участь в конце марта 2022 года.Blue Oval объявила о планах прекратить сборку среднеразмерного седана / лифтбэка и универсала на своем заводе в Валенсии в Испании из-за «растущих изменений в предпочтениях клиентов». Короче говоря, рост количества кроссоверов и внедорожников постепенно уменьшал спрос на седаны и универсалы.

Выпущенный в 1993 году в качестве замены Sierra, Mondeo разошелся примерно пятью миллионами продаж в Европе. Хотя это, несомненно, грустно видеть, как это происходит, надпись долгое время висела на стене. По словам представителя Ford, цитируемого Automotive News Europe , «рыночный сегмент, в котором конкурирует Mondeo, сокращается в течение многих лет и с 2000 года сократился примерно на 80 процентов.«

18 Фото

Когда-то ставший звездой европейского модельного ряда Ford, за Mondeo может последовать главный конкурент Volkswagen Passat, поскольку седан-версия когда-то чрезвычайно успешной немецкой модели, как утверждается, также будет снята с производства. VW Group подтвердила модель следующего поколения, но в сообщениях говорится, что она будет продаваться исключительно как универсал. Было объявлено о новом поколении Skoda Superb, поэтому люди, не увлекающиеся внедорожниками, по-прежнему будут иметь традиционную модель в сегменте среднего размера.Также доступны Peugeot 508 и Opel / Vauxhall Insignia, а также несколько седанов премиум-класса, поэтому не все потеряно в этом сегменте.

Имейте в виду, что Mondeo не исчезнет полностью, поскольку Ford все еще продает автомобиль в Китае, где он был обновлен в прошлом году с массивным 12,8-дюймовым вертикальным экраном. Покупатели в Китайской Народной Республике по-прежнему очень любят седаны, так что есть неплохой шанс, что Mondeo продолжит производство на местном рынке в последующие годы. Глядя на обширное семейство седанов VW Group в стране, стиль кузова останется неизменным.

Это, конечно, не стало шоком. Ford снимает с производства Mondeo в Европе, но мы несколько удивлены, узнав, что производство минивэнов Galaxy и S-Max будет продолжено в Валенсии. Ожидается, что косвенная замена европейского Mondeo и североамериканского Fusion примет форму поднятого прочного фургона. Он был замечен несколько раз и может дебютировать позже в 2021 году, но неясно, сохранит ли он эти имена.

Что касается завода в Валенсии, Ford вкладывает средства, чтобы начать производство 2.5-литровый гибридный двигатель Duratec с конца 2022 года для европейского рынка. Компания также активизирует сборку аккумуляторных батарей, чтобы подготовиться к быстро приближающейся электрической эре, поскольку к 2030 году Blue Oval будет продавать в Европе только легковые электромобили. Коммерческие автомобили с двигателями внутреннего сгорания будут по-прежнему доступны в следующем десятилетии, но только в виде подключаемых гибридных моделей, которые будут продаваться вместе с электромобилями.

Сравнить Ford Sierra 2.0 RS Cosworth 1986 с BMW E36 3 Series Cabrio 318i Automatic 1994 и Nissan Terrano II Long 2.4 1993

Тип двигателя — Количество цилиндров

MPI — Weber Marelli

Непрямой впрыск.

MPI

Продольный

Продольный

Продольный

Объем двигателя — Рабочий объем — Объем двигателя

1993 см3 / 121,6 куб. Дюймов

1796 см3 / 109,6 куб. Дюймов

2389 см3 / 145,8 куб. Дюймов

90,8 мм / 3,54 дюйма

84,0 мм / 3,31 дюйма

89.0 мм / 3,5 дюйма

77,0 мм / 3,03 дюйма

81,0 мм / 3,19 дюйма

96,0 мм / 3,78 дюйма

Комбинированная мощность (электрическая + горючая)

Комбинированный крутящий момент (Электрический + Горючий)

Максимальная мощность — Выходная мощность —

204 л.с. / 201 л.с. / 150 кВт

116 л.с. / 114 л.с. / 85 кВт

124 л.с. / 122 л.с. / 91 кВт

Максимальная мощность — Выходная мощность — Обороты в лошадиных силах

276 Нм / 203 фунтов.фут

168 Нм / 123 фунт-фут

197 Нм / 145 фунт-фут

Количество электродвигателей

Ведущие колеса — Тяга — Трансмиссия

Коробка передач Коробка передач — Количество скоростей

Размер, габариты, аэродинамика и вес

261,0 см / 102,76 дюйма

270,0 см / 106,3 дюйма

265,0 см / 104,33 дюйма

446,0 см / 175,59 дюйма

443,3 см / 174,53 дюйма

458.0 см / 180,31 дюйма

173,0 см / 68,11 дюйма

171,0 см / 67,32 дюйма

174,0 см / 68,5 дюйма

138,0 см / 54,33 дюйма

134,8 см / 53,07 дюйма

181,0 см / 71,26 дюйма

Коэффициент аэродинамического сопротивления — Cx

Передние тормоза — Размер диска

Задние тормоза — Dics размеры

Передние шины — Размер колесных дисков

205/50 R15

205/60 R15

215/80 R15

Задние шины — Размеры дисков

205/50 R15

205/60 R15

215/80 R15

1205 кг / 2657 фунтов

1410 кг / 3109 фунтов

1781 кг / 3926 фунтов

Максимум.Буксирная масса

Соотношение масса-выходная мощность

5,91 кг / л.с.

12,16 кг / л.с.

14,36 кг / л.с.

353-1465 л

230 л

115-1900 л

Независимый. Макферсон. пружины винтовые

стойки McPherson. Винтовые пружины.

Независимый. Двойные поперечные рычаги. анти-ролл-бар. Торсион

Независимые поперечные рычаги. винтовые пружины

винтовые пружины.

Ось De Dion.Винтовые пружины. стабилизатор поперечной устойчивости

240 км / ч / 149 миль / ч

189 км / ч / 117 миль / ч

160 км / ч / 99 миль / ч

Ускорение от 0 до 60 миль / ч (от 0 до 96 км / ч)

Время разгона от 0 до 100 км / ч (от 0 до 62 миль / ч)

Разгон от 0 до 400 м (1/4 четверти мили)

Расход топлива (экономия), выбросы и запас хода

Расход топлива — экономичный — в смешанном цикле

9,7 л / 100 км / 24 миль на галлон США / 29 миль на галлон Великобритании

9.3 л / 100 км / 25 миль на галлон США / 30 миль на галлон Великобритании

11,4 л / 100 км / 21 миль на галлон США / 25 миль на галлон Великобритании

Расход топлива — Экономичный — Открытая дорога

7,2 л / 100 км / 33 миль на галлон США / 39 миль на галлон Великобритания

Расход топлива — Экономичный — Трасса

Расход топлива — Эконом — Город

13,0 л / 100 км / 18 миль на галлон США / 22 миль на галлон Великобритания

Расход топлива — Экономия — Низкий WLTP

Расход топлива — Экономичный — Средний WLTP

Расход топлива — Экономия — Высокий WLTP

Расход топлива — Экономия — Сверхвысокий WLTP

Расход топлива — Экономия — Смешанный WLTP

618 км / 384 миль

666 км / 414 миль

701 км / 436 миль

Среднее потребление энергии

Среднее потребление энергии WLTP

60 литров / 15.9 галлонов США / 13,2 галлона Великобритании

62 литра / 16,4 галлона США / 13,6 галлона Великобритании

80 литров / 21,1 галлона США / 17,6 галлона Великобритании

232 г / км (оценка)

222 г / км (оценка)

272 г / км (оценка)

Прямая отгрузка и косвенные последствия

Адвокат по напиткам Линдси Зан рассматривает последствия конфронтации между Empire Wines и Управлением по продаже алкогольных напитков штата Нью-Йорк.

При прямой доставке потребителю для U.Винодельни в Южной Африке разрешены менее чем в 40 штатах, розничным торговцам такая привилегия обычно не предоставляется.

В настоящее время большинство штатов США запрещают розничным торговцам отправлять товары напрямую потребителям даже в пределах их границ; для тех штатов, которые разрешают розничным торговцам осуществлять прямые поставки, обычно требуется какая-либо форма лицензии. В продолжающемся деле в Управлении по продаже спиртных напитков штата Нью-Йорк (NYSLA) власти утверждали, что компания Empire Wine & Spirits (Empire) нарушила обе нормативные схемы.

В августе NYSLA, агентство штата Нью-Йорк, которое регулирует торговлю алкогольными напитками и сделки в пределах штата, выпустило Уведомление о мольбе в адрес Empire.Власти утверждали, что розничный торговец из Олбани участвовал в «ненадлежащем поведении», отправляя вино потребителям за пределами штата в нарушение законов или постановлений 16 других штатов, включая Калифорнию, Иллинойс, Пенсильванию и Вирджинию. Орган власти основывает свои утверждения на 9 NYCRR 53.1 (n), положении кодекса, которое позволяет органу отозвать, приостановить или аннулировать лицензию или разрешение за «ненадлежащее поведение».

Вскоре после этого розничный торговец подал иск против NYSLA в Верховный суд штата Нью-Йорк.В своей жалобе Empire привела три основных момента:

1. Обвинения, выдвинутые против розничного продавца, нарушили статью Конституции о торговле;

2. Положение 9 NYCRR 53.1 (n) было неконституционным расплывчатым;

3. NYSLA было запрещено утверждать юрисдикцию в отношении вина, предназначенного для продажи в другом штате.

К несчастью для Empire, суд отклонил иск, предписав розничному продавцу исчерпать все административные средства правовой защиты. Таким образом, Empire должна пройти административный процесс, а затем, если все еще безуспешно, может подать иск.

С тех пор административное слушание переносилось дважды, до 23 января. Однако слушание дало больше вопросов, чем ответов.

Орган предоставил письменные заявления из различных государственных агентств, в которых излагались законы, регулирующие поставки розничных продавцов за пределами штата, но не предоставил авторов таких заявлений.Кроме того, следователь NYSLA, который изучал дело Empire, казалось, не был уверен в важных деталях. Многие представители отрасли с нетерпением ждали результатов пятничных слушаний, но в конце четырехчасового заседания обе стороны согласились вновь встретиться в следующем месяце посредством телеконференции.

Определение «ненадлежащего поведения»

В последние несколько месяцев все внимание было приковано к бездействующей статье о торговле, поскольку она поднимает интересные конституционные вопросы, но что в данном случае осталось практически незамеченным, так это то, как NYSLA может злоупотреблять своим прочтением своих собственных правил.

Это постановление, 9 NYCRR 53.1 (n), позволяет властям отменять, отзывать или приостанавливать действие лицензии или разрешения, выданных в соответствии с Законом о контроле за алкогольными напитками штата Нью-Йорк, за ненадлежащее поведение от имени лицензиата или получателя разрешения, когда поведение является «таким характер, «что, если это известно органу, он может отказать в выдаче или продлении лицензии или разрешения из-за« неудовлетворительного характера и / или пригодности такого лица ».

Фактически, власти ухватились за эту единственную фразу («ненадлежащее поведение») и прочитали ее, чтобы охватить нарушение законов других штатов, независимо от того, соблюдаются ли эти законы на самом деле.

Принимая во внимание беспрецедентную зависимость от этого правила, следует спросить: что такое «неудовлетворительный характер» и что такое «ненадлежащее поведение»? Какую свободу действий дает это постановление? Достаточно ли отгрузки вина от имени продавца потребителю в другом штате — штате, законы которого запрещают прямую доставку, — для удовлетворения этого неудовлетворительного требования по характеру или пригодности? В глазах NYSLA, безусловно, кажется, что да.

Закон Нью-Йорка против местного законодательства?

Пока административное производство не завершено и решение еще не вынесено, необходимо задуматься о прямых и косвенных результатах неблагоприятного исхода.Как и в случае с большинством действий правительства, окончательное решение NYSLA будет иметь непреднамеренные последствия. Но учитывала ли власть эти эффекты и что они могут означать для Нью-Йорка?

По-прежнему неясна сфера «ненадлежащего поведения». Рассмотрим пример винодельни в Нью-Йорке, которая, продавая вино в других штатах, нарушает определенные законы о маркировке за пределами штата.

Техас, например, требует утверждения этикеток как от федерального правительства, так и от Комиссии по алкогольным напиткам штата Техас, прежде чем вино будет отправлено в штат.Точно так же закон штата Алабама запрещает использование лица, «изображенного нескромным или чувственным образом», на этикетке, а в 2009 году запретил этикетку Cycles Gladiator с французской картиной 1895 года с обнаженной нимфой.

Эти ограничения кажутся гораздо менее серьезными, чем предполагаемые нарушения Империей, но, если они нарушены, они все равно являются нарушением закона другого штата.По мнению властей, это «ненадлежащее поведение» и, следовательно, наказуемо. Власть может сказать, что не каждого разового нарушения достаточно, и вместо этого может потребовать повторных нарушений. Но еще неизвестно, применимо ли это на практике.

Также неприятно, что этот запутанный язык может относиться к винодельням, расположенным за пределами Нью-Йорка, поскольку такие предприятия должны получить лицензию прямого грузоотправителя от NYSLA для продажи потребителям в Нью-Йорке.

Ничто в аргументации властей не предполагает, что эти винодельни за пределами штата не могут быть подвергнуты санкциям в соответствии с этим двусмысленным положением.Это вызывает тревожные вопросы у тысяч предприятий, занимающихся алкогольными напитками, которые хотят выйти на рынки Нью-Йорка. На самом деле, у немногих учреждений есть рабочая сила, чтобы внимательно следить за законами или постановлениями всех 50 штатов. Возможно, интерпретация властями собственных правил может служить препятствием для входа на рынок Нью-Йорка, и сомнительно, что правила были составлены с таким намерением.

Учитывая все это, теперь для Нью-Йорка и лицензиатов из других штатов уместно задать вопрос: хотим ли мы вести бизнес в Нью-Йорке? Стоит ли допускать возможность штрафов, судебных разбирательств и втягивания в административные слушания в Нью-Йорке просто для того, чтобы вести дела в штате? Во многих случаях ответ может быть решительным «нет».Количество клиентов или продаж может не стоить потенциальной борьбы. И это, в конце концов, потеря для жителей Нью-Йорка; меньший выбор для потребителей и меньший доход для производителей и розничных торговцев.

Все это сводится к одному основополагающему вопросу: не зашло ли NYSLA слишком далеко в регулировании действий, нарушающих законы другого штата, которые, как известно, не применялись соответствующими агентствами иностранного государства? В этом случае для власти может быть оправдано преследование Империи, но разве это основание для регулирования межгосударственной торговли?

Восстановление продолжается в странах G7, но страны с развивающейся экономикой неоднородны, по данным ОЭСР

11/03/2014-В странах с развитой экономикой происходит восстановление, поддерживаемое благоприятными финансовыми условиями и уменьшением сопротивления от ужесточения бюджета, но активность на основных развивающихся рынках неоднородна, согласно последней промежуточной экономической оценке ОЭСР.

Посмотреть презентацию

Восстановление идет хорошо в Соединенных Штатах и ​​Соединенном Королевстве, но более неравномерно в Японии и все еще отстает в зоне евро. Ряд разовых факторов — суровая зимняя погода в Северной Америке и ожидание повышения налога на потребление в Японии в апреле 1 ^— — привели к неравномерным темпам роста.

Некоторые крупные страны с развивающейся экономикой продолжают расти быстрыми темпами, в том числе Китай, но другие потеряли динамику.Более жесткие финансовые условия усугубляют замедление роста в странах с развивающейся экономикой.

По прогнозам ОЭСР, рост в США во втором квартале 2014 года будет составлять 3,1 процента в годовом исчислении после того, как на экономическую активность в первом квартале негативно повлияла исключительно холодная погода.Экстремальные погодные условия также повлияли на Канаду, которая, как ожидается, испытает такой же неравномерный рост в первом квартале, за которым последует восстановление во втором квартале, что должно поднять темпы роста до 2,4 процента.

Согласно прогнозам, запланированная фискальная консолидация в Японии приведет к краткосрочному росту. Ожидается, что введение более высокой ставки налога на потребление приведет к всплеску активности в текущем квартале, поскольку потребители продвигают покупки, что приведет к росту до 4 в годовом исчислении.8 процентов. Это будет уравновешено сокращением активности во втором квартале, прежде чем восстановится более нормальная картина.

Согласно прогнозам, рост в Великобритании в первом и втором кварталах будет превышать 3 процента в годовом исчислении, но темпы роста в зоне евро, хотя и улучшаются, по-прежнему отстают от других стран с развитой экономикой.

Значительные диспропорции по-прежнему наблюдаются в Европе, где три крупнейшие экономики (Германия, Франция и Италия) будут расти с совокупным средневзвешенным значением 1.Ставка в первом квартале составила 9 процентов, а во втором — 1,4 процента. Прогнозируется, что в Германии рост составит около 3,7 процента в годовом исчислении в первом квартале и на 2,5 процента во втором квартале, в то время как годовые темпы роста экономики Франции будут колебаться около 1 процента, а в Италии — ниже 1 процента в каждом из первых двух кварталов.

Чтобы получить доступ к последним сводным опережающим индикаторам, пожалуйста, перейдите по этой ссылке.

Для получения дополнительной информации журналистам следует обращаться в Управление СМИ ОЭСР ([email protected]; +33 1 45 24 97 00)

Для получения дополнительной информации посетите: www.oecd.org/eco/economicoutlook.htm

Runx1 формирует хроматиновый ландшафт с помощью каскада прямых и косвенных целей

Abstract

Фактор транскрипции 1, связанный с Runt (Runx1), может действовать как активатор, так и репрессор.Здесь мы показываем, что CRISPR-опосредованная делеция Runx1 в мышиных клетках mK4, происходящих из метанефрической мезенхимы, приводит к крупномасштабным изменениям доступности хроматина и экспрессии генов во всем геноме. Открытые области хроматина рядом с подавленными локусами, обогащенными сайтами Runx в клетках mK4, теряют доступность хроматина в клетках с нокаутом Runx1 , несмотря на то, что остаются связанными с Runx2. Неожиданно области вблизи генов с повышенной регуляцией лишены Runx сайтов и вместо этого обогащены сайтами связывания факторов транскрипции Zeb.Повторная экспрессия Zeb2 в Runx1 нокаутных клетках восстанавливает супрессию, а CRISPR-опосредованная делеция Zeb1 и Zeb2 фенокопирует приобретенную экспрессию и изменения доступности хроматина, наблюдаемые в Runx1KO, частично из-за последующей активации факторов, подобных Grhl2. Эти данные подтверждают, что активность Runx1 уникально необходима для поддержания открытого хроматина во многих локусах, и демонстрируют, что белки Zeb необходимы и достаточны для поддержания Runx1-зависимой репрессии в масштабе генома.

Информация об авторе

Факторы транскрипции, связанные с Runt (Runx) 1 и 2, влияют на развитие и заболевание, активируя или подавляя транскрипцию.В этой рукописи мы использовали инструменты редактирования генома для удаления Runx1 и, как и ожидалось, наблюдали широко распространенные изменения в доступности хроматина. Недавно закрытые области содержали сайты связывания Runx1 и были обогащены рядом с генами, экспрессия которых зависела от Runx1. Интересно, что это происходит, несмотря на продолжающееся связывание Runx2 с теми же участками ДНК, что указывает на то, что Runx2 недостаточен для поддержания открытого хроматина и экспрессии генов-мишеней Runx1 в этом клеточном контексте. Напротив, недавно открытые области хроматина, многие близкие к генам, которые активируются в нокаутных клетках Runx1, не обогащаются сайтами связывания Runx1.Вместо этого эти области были обогащены сайтами для репрессорных белков Zeb. Мы обнаружили, что потеря экспрессии Zeb 1 и 2, прямых транскрипционных мишеней Runx1, приводит к открытию хроматина и активации генов, находящихся рядом с недавно открытыми сайтами в нокаутных клетках Runx1. Те же самые сайты были открытыми и близлежащие гены экспрессировались в отредактированных клетках, нокаутированных по Zeb1 и Zeb2. Среди них были факторы транскрипции, такие как ген Grhl2, которые, в свою очередь, связываются со своими генами-мишенями и активируют их.Таким образом, потеря одного фактора транскрипции запускает каскад прямых и косвенных ответвлений с вероятными негативными последствиями для развития и здоровья.

Образец цитирования: Hass MR, Brissette D, Parameswaran S, Pujato M, Donmez O, Kottyan LC, et al. (2021) Runx1 формирует хроматиновый ландшафт с помощью каскада прямых и косвенных мишеней. PLoS Genet 17 (6): e1009574. https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009574

Редактор: Джон М.Greally, Медицинский колледж Альберта Эйнштейна, США

Поступило: 12 октября 2020 г .; Одобрена: 3 мая 2021 г .; Опубликован: 10 июня 2021 г.

Авторские права: © 2021 Hass et al. Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания автора и источника.

Доступность данных: Все данные секвенирования были депонированы в Gen Expression Omnibus (GEO) и могут быть расположены под номером доступа GSE158093.

Финансирование: Эта работа стала возможной благодаря финансированию из следующих источников: R01 GM055479 для R.K. и M.T.W., R01 NS099068, M.T.W. и награды попечителя детской больницы Цинциннати, премии Центра детской геномики и премии CCRF Endowed Scholar Award для M.T.W. Финансирующие организации не играли никакой роли в дизайне исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.

Конкурирующие интересы: Авторы заявили, что никаких конкурирующих интересов не существует.

Введение

Геномы млекопитающих кодируют более 1000 факторов транскрипции (TF), которые точно контролируют экспрессию генов посредством сложных комбинаторных взаимодействий и транскрипционных каскадов [1], выполняя первый шаг в переводе последовательности геномной ДНК в функцию. Для достижения этой точности TF используют широкий спектр механизмов, включая инициирование активации или репрессии экспрессии генов напрямую или посредством набора кофакторов, инициирование новых взаимодействий петель хроматина между энхансерами и промоторами-мишенями и изменение ландшафта хроматина через репозиционирование нуклеосом [2].Таким образом, понимание механизмов, лежащих в основе точного контроля экспрессии генов, является постоянной и фундаментальной целью молекулярной биологии.

Члены семейства Runx / Runt TF распознают характерный ДНК-связывающий мотив TGTGGT, консервативны у всех многоклеточных [3] и играют важную роль в развитии и заболевании [4,5], особенно во время гематопоэза [6,7], развития кожи. [8–10] и окостенение [4,11–13]. Белки Runx могут действовать как репрессоры, рекрутируя белки Groucho / TLE через C-концевой тетрапептид WRPY, или как активаторы, путем гетеродимеризации с Core связывающим фактором (CBF) ß и рекрутируя активаторы, специфичные для клеточного контекста.Хотя белки Runx часто играют избыточные роли при совместной экспрессии с учетом их гомологичных белковых структур, зависящие от посттрансляционных модификаций взаимодействия кофакторов обеспечивают уникальные функции специфических белков Runx [14–16]. В нескольких контекстах развития белки Runx взаимодействуют с Notch, иногда способствуя активности Notch [17,18], а в других случаях действуя ниже Notch [19]. Роль, которую Runx1 играет в установлении доступности хроматина, была изучена довольно подробно в гематопоэтической системе [20], где он действует, чтобы поддерживать доступность хроматина.Однако, как белки Runx влияют на регуляторные сети генов в различных клеточных контекстах, еще предстоит выяснить.

Мы использовали клетки mK4, полученные из метанефрической мезенхимы мышей, потому что они напоминают клетки, претерпевающие мезенхимальный переход в эпителиальный [21], который является критическим для развития почек процессом. Ранее мы обнаружили, что сайты связывания Runx были обогащены рядом с Notch-связанными энхансерами в клетках mk4 [22]. Два из трех паралогов Runx, Runx1 и Runx2, экспрессируются в клетках mK4 [21], облегчая детальное молекулярное сравнение функций Runx1 и Runx2 в регуляции экспрессии генов и их интеграции с множественными путями передачи сигналов.Такому анализу в клетках mK4 дополнительно способствует нормальный кариотип, легкость генетических манипуляций, опосредованных CRISPR, и короткое время удвоения, что обеспечивает достаточный материал для различных геномных анализов.

В этом исследовании мы показываем, что Runx1 играет важную роль в регуляции доступности хроматина во многих геномных локусах в клетках mK4. В отсутствие Runx1 Runx2 связывает большую часть хроматина, связанного с Runx1, но не может поддерживать Runx1-зависимую доступность или экспрессию гена.Поскольку Runx1 может подавлять экспрессию некоторых генов, мы ожидали, что повторно экспрессированные гены в клетках Runx1KO будут активно репрессироваться Runx1; однако мы были удивлены, обнаружив, что доступный хроматин рядом с локусами, экспрессируемый только после делеции Runx1, лишается сайтов Runx и вместо этого обогащается сайтами Zeb, что указывает на косвенное участие Runx1 в их регуляции. Дальнейшее исследование показало, что репрессия в нескольких локусах по всему геному опосредуется двумя Runx1-зависимыми мишенями, Zeb1 и Zeb2.Белков Zeb достаточно для репрессии, поскольку восстановление экспрессии Zeb2 в клетках Runx1KO репрессировало эктопически экспрессируемые гены в клетках Runx1KO. Мы продемонстрировали, что репрессоры Zeb необходимы для репрессии в присутствии Runx1 путем инактивации Zeb1 и Zeb2 в родительских клетках mK4, которые фенокопируют доступность и экспрессию, наблюдаемые при нокауте Runx1. Таким образом, прямое воздействие Runx1 на хроматин в клетках mK4 опосредуется прежде всего его способностью способствовать и поддерживать доступность хроматина и функцию активатора транскрипции, а не через его репрессорную функцию.В совокупности эти данные обеспечивают механистическое понимание того, как Runx и Zeb TFs интерактивно контролируют экспрессию генов и помещают Runx1 на вершину каскада TF, поддерживающего глобальный ландшафт хроматина.

Результаты

Генерация и характеристика нокаутных клеток Runx1

Для создания клеток, лишенных активности Runx1, мы нацелены на Runx1 с двумя гРНК, фланкирующими экзон 3, который содержит стартовый кодон транскрипта, экспрессируемого в клетках mK4, и кодирует часть связывающего домена Runt ДНК (рис. 1А).Множественные клоны росли после отбора с пуромицином, показывая делецию целевого экзона 3 (фиг. 1A) генотипированием с помощью ПЦР и потерю белка Runx1, что подтверждено вестерн-блоттингом (фиг. 1B). Экспрессия Runx2 в этих клетках оставалась неизменной (фиг. 1B и S1). Таким образом, любые функциональные различия между клетками Runx1KO и родительскими клетками mK4 (контроль) могут указывать на потенциальные роли, специфичные для Runx1, которые не могут быть компенсированы Runx2.

Рис. 1. Получение и характеристика клеток Runx1KO.

A) Схема области экзона 3 Runx1, нацеленной на удаление с помощью CRISPR-Cas9 и подтверждение удаления с помощью ПЦР. B) Вестерн-блоттинг, показывающий, что в клетках Runx1KO отсутствует белок Runx1, но содержится Runx2. C) Схема геномных анализов, используемых для характеристики клеток Runx1KO.

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009574.g001

Чтобы определить влияние Runx1-дефицита, мы провели несколько геномных анализов, сравнивая Runx1KO с родительскими клетками mK4. В частности, мы проанализировали экспрессию генов с помощью RNA-seq, идентифицировали геномные местоположения, связанные с Runx1 и Runx2 с помощью ChIP-seq, и картировали архитектуру хроматина с помощью ATAC-seq (рис. 1C).Все эксперименты с RNA-seq, ChIP-seq и ATAC-seq проводили в трех биологических повторностях, чтобы дать возможность статистического анализа для идентификации значимых различий между контрольными клетками и клетками Runx1KO.

Дефицит Runx1 вызывает драматические изменения в экспрессии генов

РНК-seq выявил 1599 активированных и 1041 подавленных транскриптов, которые были значительно изменены в высокосогласованных репликах в клетках Runx1KO по сравнению с контрольными клетками (рис. 2А; кратное изменение> 2 раза, FDR <0.05; Таблица S1). В соответствии с предыдущими исследованиями, гены с пониженной регуляцией клеток Runx1KO были обогащены термином GO, идентифицирующим сигнальный путь рецептора TGF-beta (в 23,73 раза выше, значение p 0,0012, таблица FDR 0,039 S2) [23]. анализ активированных генов в клетках Runx1KO выявил обогащение для биологических процессов, включая процессинг и презентацию антигена (6,38-кратное обогащение, значение p 5,83 x 10 ^-07 , FDR 2,3 10 ^-04 , таблицы 1 и S2), что соответствует критическая роль, которую Runx1 играет в иммунной системе, и с наблюдениями у людей с мутациями Runx1 [24].Широко распространенные изменения в экспрессии генов, вызванные Runx1-дефицитом, согласуются с предыдущими наблюдениями отсутствия избыточности с Runx2, как видно в других клеточных контекстах [4]. Таким образом, Runx1 играет критическую роль в контроле транскриптома внутри клеток mK4 способом, который не может быть компенсирован Runx2. Затем мы исследовали, могут ли различия между эффектами Runx1 и Runx2 на экспрессию генов быть следствием различий в предпочтениях связывания ДНК или различиях в местах связывания генома.

Рис. 2. Широко распространенные транскрипционные изменения в клетках Runx1KO, несмотря на то, что Runx2 в основном занимает те же области, что и Runx1.

A) Тепловая карта тройных повторений РНК-seq, показывающая 1705 активированных и 1182 подавленных генов (более чем в 2 раза) в клетках Runx1KO по сравнению с контрольными клетками mK4. B) Тепловые карты ChIP-seq считывают отображение на пики Runx1 из Runx1 ChIP или Runx2 ChIP в контроле по сравнению с ячейками Runx1KO, причем все четыре тепловые карты являются одинаковыми местоположениями пиков Runx1 ChIP, упорядоченными по силе пика Runx1 ChIP.C) График, отображающий -log10 p-значения обогащения мотива, показывающий, что мотивы Runx1 являются наиболее высокообогащенными мотивами в пиках Runx1 ChIP. D) Диаграмма Венна, показывающая перекрытие пиков Runx1 и Runx2 ChIP. Обратите внимание, меньшее перекрытие вызываемых пиков на диаграмме Венна, вероятно, связано с тем, что сигнал Runx2 находится чуть ниже порога для вызова пика для многих пиков в нижней половине тепловой карты в A. Анализ RELI подтвердил очень значительное перекрытие микросхемы Runx1 и Runx2 (138.5-кратное обогащение, скорректированное значение p 1,45 x 10 ^-218 ).

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009574.g002

Таблица 1. Онтология генов, регулируемых Runx1.

В этой таблице показаны 5 основных категорий онтологии генов из таблицы S2, основанные на кратном обогащении для генов с пониженной регуляцией в клетках Runx1KO (вверху) или с пониженной регуляцией в клетках Runx1KO (внизу).

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009574.t001

Runx1 и Runx2 связываются рядом с генами, которые подавляются в клетках Runx1KO

Для идентификации геномных локусов, занятых белками Runx, мы выполнили Runx1 и Runx2 ChIP-seq.ChIP-seq в клетках mK4 продуцировал 10 187 пиков, которые были хорошо воспроизводимы между повторами, но не присутствовали в клетках Runx1KO, что проиллюстрировано на тепловых картах считываний ChIP-seq Runx1, сопоставленных с пиками в контрольных клетках и клетках Runx1KO (рис. 2B и S2A) и в корреляции матрица считываний пиков Runx1 ChIP между различными образцами (S2B рис.). Анализ обогащения мотивов сайта связывания фактора транскрипции HOMER с использованием мотивов мышей из базы данных Cis-BP, включая все известные мотивы для различных TF [25], выявил мотивы Runx как наиболее высокообогащенные в наборе данных контрольных клеток (p-значение 1 x 10 ^-1298 ) (рис. 2C и таблица S3).Эти данные в сочетании с ограниченным числом пиков и относительным отсутствием обогащения мотива Runx в клетках Runx1KO подтверждают специфичность антитела, используемого в анализе ChIP для идентификации геномных областей, связанных Runx1. Второй наиболее богатый класс мотивов относится к семейству AP-1, гетеродимеру, состоящему из белков, принадлежащих к семействам c-Fos, c-Jun, и ранее было показано, что он обогащен Runx1 [26] и маркерами энхансеров в большинстве клеток. типы (27). Это указывает на роль Runx1 в поддержании доступности энхансеров, позволяя связываться с др. Клеточными типами специфичных TFs [27-30].

Чтобы дополнительно определить, участвуют ли эти связанные с Runx1 области в регуляции транскрипции, мы присвоили гены пикам Runx1 ChIP с помощью инструмента аннотации GREAT [31] и сравнили гены, расположенные рядом с иммунопреципитированным хроматином, с генами, экспрессия которых изменяется более чем в 2 раза. в ячейках Runx1KO (таблица S1). Этот анализ показал, что 49% (514/1041) генов с пониженной регуляцией в клетках Runx1KO имели пик Runx1 ChIP-seq в непосредственной близости, что в 1,87 раза больше, чем ожидалось случайно (гипергеометрическое значение p 1.71 х 10 ⁻⁵⁸ ). Напротив, только 34% (545/1599) генов с усиленной регуляцией имели ближайший пик иммунопреципитации (увеличение в 1,41 раза). Хотя ограниченное перекрытие пиков Runx1 ChIP возле генов с повышенной регуляцией не может исключить возможность того, что некоторые из них могут представлять сайты репрессии, опосредованной Runx1, результаты согласуются с потерей экспрессии в клетках Runx1KO прямых мишеней Runx1 и менее согласуются с моделью в какие гены с повышенной регуляцией подавлялись непосредственно Runx1.

Неспособность Runx2 регулировать те же гены, что и Runx1, что отражено в данных RNA-seq (рис. 2A), может отражать различную занятость определенных участков генома Runx1, а не Runx2, из-за различий в предпочтениях связывания ДНК или белков. партнеры по взаимодействию. Альтернативно, Runx1 и Runx2 могут занимать одни и те же локусы, но Runx2 может иметь разные эффекты на экспрессию генов по сравнению с Runx1. Для дальнейшего изучения этих возможностей мы выполнили Runx2 ChIP-seq как в контрольных, так и в Runx1KO ячейках.Runx2 ChIP идентифицировал комбинированные наборы из 17 595 пиков, присутствующих в контрольных клетках, и 15 608 пиков, присутствующих в клетках Runx1KO, с мотивом Runx, сильно обогащенным в обоих типах клеток (p-значение 1 x 10 ^-2244 и 1 x 10 ^-2363 соответственно (таблица S3)). Сравнение хроматина, связанного Runx1 и Runx2, выявило заметное перекрытие пиков в контрольных клетках и сохранение сигнала ChIP Runx2 на пиках Runx1 в клетках Runx1KO (фиг. 2B, 2D и S2A). Большинство пиков Runx1 обогащены чтениями Runx2 ChIP по сравнению с соседними фоновыми областями.Анализ пересечения локуса регуляторного элемента (RELI) [32] подтвердил очень значимое согласие между наборами данных Runx1 (mk4), Runx2 (mk4) и Runx2 (Runx1 KO) ChIP-seq (контрольная ячейка обогащена в 194,46 раза, p-значение 2,0 x 10 ⁻²¹⁹ ; ячейка Runx1KO, обогащенная в 177,85 раз, p-значение 2,32 x 10 ⁻²¹⁹ ; фигура S2C и таблица S4). Эти результаты предполагают, что регуляторные области рядом с генами с пониженной регуляцией в клетках Runx1KO сохраняют связывание Runx2, что, очевидно, недостаточно для управления их экспрессией.Примечательно, что анализ обогащения показал, что области Runx1 ChIP очень значительно перекрываются с FOSL1 и различными белками Jun в других типах клеток, что согласуется с наблюдаемым обогащением мотивов AP-1 в наших наборах данных ChIP и поддерживает гипотезу о том, что Runx1 связывается с энхансерами. Соответственно, пики Runx1 ChIP значительно обогащены маркерами энхансеров, такими как ацетилирование h4K27, метилирование h4K4, диметилирование h4K4, триметилирование h4K4 и чувствительность к ДНКазе во множестве типов клеток, что усиливает утверждение о том, что связанные с Runx1 области, вероятно, являются энхансерами.Мы подтвердили эти ассоциации, выполнив ChIP-seq ацетилирования h4K27 в контрольных клетках и клетках Runx1KO, которые показали, что пики ChIP-seq Runx1 значительно перекрываются с пиками ацетилирования h4K27, которые были сильнее в контрольных клетках по сравнению с клетками Runx1KO (33,36 раза, значение p 2,17 x 10–182) (Таблица S4). Фильтрация пиков Runx1 ChIP только до тех, которые перекрываются с предсказанным связыванием AP-1, показала аналогичное обогащение по ацетилированию h4K27 в контрольных клетках (обогащение Runx1 в 35,48 раза, p-значение 2,83 x 10–180).Напротив, пики Runx1 ChIP, которые не перекрывались с предсказанными сайтами связывания AP-1, не были значительно обогащены для специфичного для контрольных клеток ацетилирования h4K27. В целом, эти анализы показывают, что Runx1 обладает функцией активатора транскрипции на энхансерах в большом подмножестве своих целевых локусов. Runx2 также может связывать эти энхансеры, но этого недостаточно для поддержания открытого хроматина или активации экспрессии связанных генов.

Резкие изменения в доступности хроматина приводят к изменениям экспрессии в клетках Runx1KO

Данные Runx2 ChIP показали, что большинство регуляторных областей остаются доступными для связывания Runx2 в клетках Runx1KO (рис. 2B).Чтобы изучить доступность хроматина рядом с генами с пониженной регуляцией в клетках Runx1KO, мы затем провели эксперименты с ATAC-seq. Как и в случае данных RNA-seq и ChIP-seq, все реплики ATAC-seq были высоко воспроизводимы (S3A и S3B фиг.). Большинство открытых участков хроматина, представленных 37 481 пиками ATAC-seq, демонстрировали аналогичные уровни чтения между контрольными клетками и клетками Runx1KO, в дальнейшем называемые Runx1-независимыми пиками ATAC-seq (рис. 3A, пересекаются на диаграмме Венна, и тепловая карта на рис. 3B, левая панель). ). Примечательно, что мы также наблюдали существенную и воспроизводимую потерю доступности хроматина после удаления Runx1 — 8741 геномный локус имел значительно меньшую доступность в клетках Runx1KO по сравнению с контролем, которые мы обозначили как Runx1-зависимые пики (рис. 3A, левая уникальная область на диаграмме Венна и тепловой карте). на рис. 3В, средняя панель).Интересно, что аналогичное количество регионов (9427) продемонстрировало повышенную доступность в клетках Runx1KO по сравнению с контролем (вызванное Runx1KO; рис. 3A, уникальная область справа на диаграмме Венна и тепловая карта на рис. 3B, правая панель). Мы обозначаем эти сайты как Runx1KO-индуцированные.

Рис. 3. Удаление Runx1 изменяет доступность хроматина, несмотря на наличие Runx2.

A) Диаграмма Венна пиков ATAC-seq в контрольных клетках и клетках Runx1KO, показывающая количество областей, открытых в обеих клеточных линиях (Runx1-независимых), областей, открытых только в контрольных клетках (Runx1-зависимых), и областей, открытых только в клетках Runx1KO (Вызвано Runx1KO).B) Тепловые карты чтения ATAC-seq, отображающие Runx1-независимые, Runx1-зависимые и Runx1KO-индуцированные пики в контрольных клетках и клетках Runx1KO. C) График p-значений -log10 обогащения мотива, показывающий, что Runx1-зависимые пики ATAC-seq сильно обогащены AP-1 и мотивами Runx. D) Анализ обогащения набора генов, показывающий обогащение транскрипционно подавляемых генов (синим цветом и повышенная регуляция красным) зависимыми от Runx1 пиками ATAC-seq, которые связаны с Runx1. E) Тепловая карта, показывающая Runx1-зависимые области ATAC-seq, связанные в экспериментах Runx1 и Runx2 ChIP.F) Снимки генома генов Gdnf и Pak3 , которые подавлены в клетках Runx1KO, демонстрируют открытые области хроматина, присутствующие в контрольных клетках, но не клетки Runx1KO, которые связаны с Runx1 и Runx2 и сохраняют связывание Runx2 в клетках Runx1KO. G) Геномный снимок гена с пониженной регуляцией Runx1KO, Osr1 , который имеет области генома, которые теряют доступность хроматина в клетках Runx1KO, которые связаны с Runx1 и Runx2 в контрольных клетках, с пониженным связыванием Runx2 в клетках Runx1KO.

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009574.g003

Эти изменения в доступности хроматина могут отражать функционирование Runx1 как активатора в некоторых локусах (т. е. путем открытия или поддержания доступности сайтов, зависимых от Runx1) и репрессор в других (то есть, сохраняя сайты, индуцированные Runx1KO, недоступными). Если Runx1 непосредственно действует таким образом и как активатор, и как репрессор, то можно ожидать, что оба класса будут обогащены мотивами Runx1.Чтобы проверить эту гипотезу, мы повторили анализ, описанный выше, и снова обнаружили сильное обогащение мотивов AP-1 (p-значение 1 x 10 ^-1601 ), в дальнейшем вовлекая Runx1-зависимые области ATAC-seq в качестве энхансеров (рис. 3C и S3. Таблица). 2-м наиболее обогащенным классом мотивов в Runx1-зависимых областях открытого хроматина был Runx (p-значение 1 x 10 ^-388 ), и, как и ожидалось, набор данных имел очень значимое перекрытие с нашими данными Runx1 ChIP (26,43-кратное обогащение, p-поправка Бонферрони скорректировала p -значение 2.16 х 10 ⁻²¹¹ ; Таблица S4). Это обогащение пиков Runx1 ChIP в пределах Runx1-зависимых пиков ATAC-seq было почти в 10 раз выше, чем обогащение пиков Runx1 ChIP в пиках Runx1KO-индуцированных ATAC-seq (5,2-кратное обогащение, скорректированное значение p 9,1 x 10 ^-67 ), что согласуется с ролью Runx1 в продвижении и поддержании открытого хроматина в этих клетках, но не с Runx1 в поддержании репрессии. Поскольку анализ обогащения обнаружил значительное обогащение наших сайтов mK4 Runx1 ChIP в AML (10.73-кратное обогащение, значение p 8,42 x 10 ⁻¹⁶⁸ ) и клетки HPC-7 (обогащение в 9,73 раза, значение p 1,13 x 10 ⁻¹⁴³ ; таблица S4), они могут быть функционально важными Runx1-зависимыми энхансерами в несколько сотовых контекстов. Затем мы назначили Runx1-зависимые области ATAC-seq соседним Runx1-зависимым транскриптам с помощью инструмента аннотации GREAT [31]. Runx1-зависимые области ATAC-seq были обогащены в 3,12 раза рядом с подавленными генами в клетках Runx1KO (гипергеометрическое значение p = 4,80 x 10 ^-200 ), как ожидалось от Runx1-зависимого поддержания энхансеров, регулирующих экспрессию близлежащих генов.

ChIP Runx1, полученные в контрольных клетках, выявили обширное связывание Runx1 как в пределах Runx1-зависимых пиков, так и пиков, которые остаются открытыми в отсутствие Runx1 (Фиг.3A и 3B и S3C Fig). Однако области, которые связаны в Runx1 ChIP, но становятся недоступными в клетках Runx1KO (Runx1-зависимые), демонстрируют сильное обогащение (4,08 раза, гипергеометрическое значение p 1,74 X 10 ^-67 ) проксимальных генов, экспрессия которых снижается в клетках Runx1KO ( Рис 3D). Таким образом, комбинация данных ATAC-seq и ChIP помогает определить набор функциональных, Runx1-зависимых регуляторных областей в геноме mK4 и поддерживает вывод о том, что функция активатора Runx1 связана с его ролью в поддержании доступного хроматина в клетках mK4.

Зависимые от Runx1 области, которые становятся менее доступными в отсутствие Runx1 в клетках, экспрессирующих Runx2, могут сделать это, потому что эти специфические области связаны только с Runx1, а не с Runx2. Чтобы проверить эту гипотезу, мы сравнили чтение Runx2 ChIP-seq с тремя классами пиков ATAC-seq, показанными на рис. 3A. Примечательно, что сигнал Runx2 ChIP присутствовал как в Runx1-независимой, так и в Runx1-зависимой областях ATAC-seq (фиг. 3E), а также в клетках mK4 и Runx1KO (фиг. S3B). Например, мы показываем, что предполагаемые энхансеры, расположенные рядом с регулируемыми генами Runx1 Gdnf и Pak3 [33–37] (рис. 3F, зеленые стрелки), стали недоступными в клетках Runx1KO (рис. 3F, красные стрелки), в то же время сохраняя связывание Runx2. (Рис. 3F, зеленая стрелка).Дополнительные примеры представлены в качестве дополнительных данных, чтобы продемонстрировать, что этот образец сохраняющегося связывания Runx2 в отсутствие пика ATAC-seq типичен для генов, экспрессия которых снижена в клетках Runx1KO (фиг. S4A; воспроизводимость между тремя повторами, показанными на фиг. S5A и S5B). Эти данные подтверждают, что хотя Runx2 может связываться с закрытым хроматином подобно Runx1 [20], он не может делать хроматин доступным для других факторов.

В других областях, зависимых от Runx1, привязка Runx2 значительно снижена. Например, два потенциальных энхансера около Osr1 , о котором сообщается о гене-мишени Runx [38], открыты и связываются как Runx1, так и Runx2 в контрольных клетках (рис. 3G, зеленые стрелки), но становятся недоступными из-за ограниченного связывания Runx2 в клетках. Ячейки Runx1KO (рис. 3G, красные стрелки).Чтобы спросить, были ли сайты, которые теряют связывание Runx2 в клетках Runx1KO, обогащены рядом с генами с пониженной регуляцией, мы разделили Runx1-зависимые области ATAC-seq, связанные с Runx1, на две группы: те сайты, которые имеют перекрывающийся пик Runx2 ChIP в клетках Runx1KO, и те сайты, которые не сделал (S4B рис). Обогащающий анализ этих двух групп, выполненный, как указано выше, выявил аналогичное сильное обогащение по подавленным генам рядом с сайтами, иммунопреципитированными Runx2 в клетках Runx1KO (4,14-кратное обогащение, гипергеометрическое значение p 5.41 X 10 ^-60 ) и рядом с сайтами, не иммунопреципитированными Runx2 в клетках Runx1KO (4,12-кратное обогащение, гипергеометрическое значение p 9,01 x 10 ^-15 ). В совокупности данные Runx1 и Runx2 ChIP и последующий анализ обогащения показывают, что Runx1 связывается и способствует или поддерживает доступность хроматина в большом количестве локусов, многие из которых связаны с Runx1-чувствительными генами. Несмотря на то, что он остается связанным с этими же регионами в отсутствие Runx1, Runx2 не может компенсировать отсутствие Runx1.

Runx1KO-индуцированные области хроматина открываются из-за потери репрессоров транскрипции Zeb

Проведенный выше анализ предполагает, что хотя Runx1KO-индуцированные области ATAC-seq требуют, чтобы Runx1 оставался недоступным, отсутствие связывания Runx1 с этими областями согласуется с непрямой репрессией с помощью Runx1. Чтобы изучить возможность того, что конкретный Runx1-зависимый белок (-ы) поддерживает репрессию, мы выполнили анализ обогащения связывающих мотивов TF на этих сайтах. Действительно, мотивы Runx отсутствовали в верхних 1500 обогащенных мотивах (таблица S3), что согласуется с косвенным механизмом, посредством которого Runx1 действует либо путем репрессии активатора, либо путем активации репрессорного белка.Анализ обогащения мотивов пиков ATAC-seq, вызванных Runx1KO, по сравнению с Runx1-зависимыми сайтами ATAC-seq выявил значительное обогащение репрессорного мотива Zeb (рис. 4A и S6A), что согласуется с механизмом, в котором Runx1 регулирует экспрессию Zeb, которая, в свою очередь, активно поддерживает недоступная архитектура хроматина на нескольких сайтах. Соответственно, мы наблюдали, что уровни мРНК Zeb1 и Zeb2 были более чем в 10 раз ниже в клетках Runx1KO (фиг. 4B), что независимо подтверждено количественной ПЦР в реальном времени (RT-qPCR; S6D Fig).Используя вестерн-блот-анализ, мы обнаружили, что белок Zeb1 экспрессируется в контрольных клетках, но не в клетках Runx1KO (рис. 4C). К сожалению, коммерчески доступные антитела к Zeb2 не смогли обнаружить его в контрольных клетках. Затем мы спросили, является ли Runx1 прямым регулятором экспрессии Zeb1, исследуя локус Zeb1 на связывание Runx1. Доступная регуляторная область рядом с Zeb1 была связана с Runx1 и Runx2 в контрольных клетках (рис. 4D, зеленые стрелки), но стала недоступной в клетках Runx1KO (рис. 4D, красные стрелки).Сходным образом доступная регуляторная область рядом с Zeb2, связанная с Runx1 и Runx2 в контрольных клетках, стала недоступной в клетках Runx1KO (рис. 4E). Кроме того, TSS Zeb1 и Zeb2, открытые в контрольных клетках, были менее доступны в клетках Runx1KO (рис. 4E и S6B), что отражает резкие различия в уровнях экспрессии Zeb1 и Zeb2 между контрольными клетками и клетками Runx1KO. Эти данные предполагают, что и Zeb1, и Zeb2 регулируются Runx1-зависимыми энхансерами в клетках mK4.

Рис. 4. В клетках Runx1KO отсутствуют репрессоры Zeb, ведущие к открытию хроматина.

A) График, отображающий p-значения обогащения мотивов фактора транскрипции в Runx1-зависимом по сравнению с Runx1-индуцированным ATAC-seq, показывая, что мотивы Zeb специфически обогащены пиками ATAC-seq, индуцированными Runx1KO. Кроме того, мотивы Ctcf, Klf и Grhl обогащены пиками ATAC-seq, индуцированными Runx1KO, тогда как мотивы Runx обогащены Runx1-зависимыми ATAC-seq. Обратите внимание, что на этом графике были удалены результаты обогащения мотивов AP-1, чтобы сосредоточиться на других уровнях обогащения мотивов (см. Фиг. S6A для всех мотивов факторов транскрипции).B) RT-qPCR, показывающий, что клетки Runx1KO теряют экспрессию Zeb1 и Zeb2. C) Вестерн-блоттинг, показывающий отсутствие белка Zeb1 в клетках Runx1KO. D) Геномный снимок, показывающий область хроматина около Zeb1 , которая связана с Runx1 и Runx2 и теряет доступность хроматина в клетках Runx1KO. E) Геномный снимок локуса Zeb2 , показывающий нисходящий потенциальный энхансер, связанный с Runx1 и Runx2, который снижает доступность хроматина вместе с потерей экспрессии в клетках Runx1KO.F) Геномный снимок локуса гена-мишени Zeb Pard6b , показывающий промоторную область, содержащую предсказанный сайт связывания Zeb, который специфически открыт в клетках Runx1KO. G) RT-qPCR, показывающая, что временная трансфекция Zeb2 клеток Runx1KO индуцирует репрессию экспрессии Pard6b до уровней, аналогичных уровням в контрольных клетках, после 1 дня отбора для трансфицированных клеток с последующими 2 днями роста в среде. (* = p-значение <0,05, ** = p <0,005; *** = p-значение <0.0005).

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009574.g004

В подтверждение гипотезы о том, что открытие хроматина в клетках Runx1KO происходит из-за потери репрессоров Zeb, мы исследовали известную репрессированную мишень Zeb1, Pard6b , который был повышен в клетках Runx1KO почти в 10 раз на основании анализа РНК-seq (S6C фиг.) И RT-qPCR (S6D фиг.). Предполагаемый сайт связывания Zeb перед Pard6b доступен только в клетках Runx1KO (рис. 4F).Таким образом, мы предположили, что субнабор генов, активируемых в клетках Runx1KO, может быть результатом потери Runx1-зависимой экспрессии Zeb 1 и Zeb2 и последующей дерепрессии Zeb мишеней.

Чтобы проверить, была ли экспрессия Zeb достаточной для отмены прироста экспрессии генов, наблюдаемого в клетках Runx1KO, мы временно трансфицировали клетки Runx1KO с помощью вектора экспрессии, управляющего уровнями мРНК Zeb2 в 330 раз по сравнению с исходным уровнем, как определено с помощью RT-qPCR (рис. 4G, слева — напомним, что там не является пригодным для использования антителом к ​​Zeb2).Затем мы проверили экспрессию Pard6b в клетках Runx1KO, трансфицированных Zeb2, и обнаружили, что уровень его экспрессии был значительно снижен (рис. 4G, справа). Поскольку уровни экспрессии Pard6b не полностью вернулись к контрольным уровням, могут быть дополнительные белки, способствующие его регуляции. Альтернативно, стабильная экспрессия Zeb может потребоваться в течение более длительного периода. Это подтверждает гипотезу, что многие из генов с повышенной регуляцией в клетках Runx1KO могут быть косвенно затронуты посредством потери Zeb-опосредованной репрессии.

Не весь открытый хроматин, полученный в клетках Runx1KO, содержит сайты Zeb. Мотивы Grhl значительно обогащены небольшим подмножеством Runx1KO-индуцированных фрагментов ATAC-seq, в которых отсутствуют мотивы Zeb (фиг. 4A и таблица S3). Геномный снимок локусов Grhl2 выявляет участки хроматина, содержащие мотив Zeb, которые становятся доступными в клетках Runx1KO (рис. 5F), одновременно с повышенной экспрессией Grhl2 , что позволяет предположить, что Grhl2 подавлялся с помощью Zeb в клетках mK4. Как мы наблюдали для Pard6b , Zeb2 -экспрессирующие клетки Runx1KO демонстрируют значительное подавление экспрессии Grhl2 с помощью RT-qPCR (рис. 5A), что согласуется с гипотезой о том, что белков Zeb достаточно для восстановления репрессии.

Рис. 5. Потеря белков Zeb повторяет открытие хроматина и индукцию транскрипции Runx1KO.

A) Подтверждение RT-qPCR позитивной регуляции Grhl2 в клетках Runx1KO, которая подавляется временной трансфекцией Zeb2. B) ПЦР для генотипирования, показывающая делеции экзона 2 Zeb1 и экзона 1 Zeb2 в клонах ZebDKO. C) Вестерн-блот-подтверждение потери белков Zeb1 в клетках ZebDKO. D) RT-qPCR, показывающий, что клетки ZebDKO имеют резкое увеличение экспрессии Grhl2.E) Диаграмма разброса, показывающая корреляцию изменений экспрессии генов в клетках Runx1KO и ZebDKO по сравнению с контрольными клетками mK4 (светло-серые все гены, темно-серые гены с 2-кратным изменением экспрессии в обоих и черные гены с более чем 4-кратным изменением экспрессии в оба). F) Grhl2 локусов, отображающих области ATAC-seq, которые специфически открыты в клетках Runx1KO (обведены красным), которые содержат предсказанные сайты связывания Zeb. G) Графики данных ATAC QPCR, показывающие, что области около Grhl2 , которые были открыты в клетках Runx1KO, аналогично становятся значительно более открытыми в клетках ZebDKO, в то время как контрольные открытые и закрытые области аналогичны между контрольными клетками и клетками ZebDKO.(* = p-значение <0,05, ** = p <0,005; *** = p-значение <0,0005).

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009574.g005

Чтобы напрямую проверить, отвечает ли потеря экспрессии Zeb за открытие хроматина и активацию гена, наблюдаемую в клетках Runx1KO, мы снова использовали CRISPR-Cas9 для нокаута как Zeb1, так и Zeb2 для создания клеток ZebDKO. Мы успешно получили несколько клонов, которые удалили экзоны, содержащие стартовый кодон для каждого (фиг. 5B), и подтвердили потерю белка Zeb1 (фиг. 5C).Анализ глобальной экспрессии с помощью RNA-seq подтвердил, что большая часть дерегуляции транскрипции, наблюдаемая в клетках Runx1KO, повторяется в клетках ZebDKO, как показано на диаграмме разброса, сравнивающей дифференциально экспрессируемые гены (DEG) в Runx1KO по сравнению с контрольными клетками mK4 с таковыми в ZebDKO vs. • контрольные клетки mK4 (фиг. 5E). Эти результаты дополнительно проиллюстрированы на тепловой карте генов, отображающих более чем 2-кратное изменение уровней экспрессии в повторах, сравнивающих контрольные клетки с клетками Runx1KO и ZebDKO (S7C фиг.).Анализ обогащения набора генов (GSEA) показал, что обогащение генов, активированных в клетках Runx1KO, среди генов значительно увеличилось в клетках ZebDKO (S7D фиг.). В частности, мы подтвердили, что Grhl2 , Pard6b и Itgb4 были активированы в Runx1-экспрессирующих клетках ZebDKO с помощью RT-qPCR (фиг. 5D, S7A и S7B). Обогащение мотивов Grhl в Runx1KO-индуцированной ATAC-seq и активация мишеней Grhl2 (Ovol1, Cldn4 и Cgn) в наборах данных Runx1KO и ZebDKO RNA-seq (таблица S1) предполагают, что дерепрессия Grhl2 имеет важные функциональные последствия. in vitro .Более того, репрессия Grhl2 с помощью Zeb играет критическую роль во взаимных петлях отрицательной обратной связи между этими факторами во время эпителиально-мезенхимального перехода (EMT) [39]. Эти наблюдения побудили нас проанализировать регуляторную область Grlh3 как репрезентативную мишень Zeb. Чтобы определить, вызвана ли активация транскрипции в клетках ZebDKO открытием хроматина вблизи этого DEG, мы выполнили ATAC в клетках ZebDKO и использовали QPCR для сравнения обогащения нескольких предполагаемых энхансеров вблизи локуса Grhl2 (-40kb, -69kb и -74kb) рядом с локусом Grhl2 на их статус в контрольных клетках mK4.Доступные области, полученные в ячейках Runx1KO, также были более доступны в ячейках ZebDKO по сравнению с контролем. Напротив, конститутивно открытые (-32kb) или недоступные (-36kb) области были неотличимы между контрольными клетками и клетками ZebDKO (рис. 5G). В совокупности нокаут Zeb в клетках, экспрессирующих Runx1, и сверхэкспрессия в клетках Runx1KO демонстрируют, что белки Zeb необходимы и достаточны для подавления когорты мишеней, активируемых в клетках Runx1KO, а потеря Runx1 вызывает каскад TF из-за дерепрессии Zeb.Таким образом, эти результаты показывают, что Runx1 является ключевым фактором, потеря которого создает волновые эффекты, возмущающие всю транскрипционную сеть (Рис. 6).

Рис. 6. Модель нарушения сети факторов транскрипции из-за дефицита Runx1.

A) В контрольных клетках mK4 Runx1 индуцирует репрессоры транскрипции Zeb1 и Zeb2, которые ингибируют другие активаторы транскрипции, такие как Grhl2, что приводит к ингибированию последующих генов-мишеней Grhl2. B) Клетки Runx1KO теряют экспрессию Zeb1 и Zeb2, что дерепрессирует их мишени, включая Grhl2 и Klf2, что, в свою очередь, приводит к усилению регуляции их нижестоящих мишеней, таких как Ovol1, Cldn4 и Cgn.Рисунок был создан с помощью BioRender.com.

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009574.g006

Discussion

Мы сообщаем здесь, что Runx1 регулирует ландшафт хроматина прямо и косвенно, широко воздействуя на транскрипцию во множестве локусов в линии клеток, полученных из почек мыши. Несмотря на то, что Runx1, как сообщается, является одновременно активатором транскрипции и репрессором [4,40,41], наши анализы показывают, что Runx1 функционирует в первую очередь как активатор в клетках mK4, несмотря на присутствие его корепрессора Gro / TLE1-3 ( Таблица S1).Runx1 делает это, поддерживая доступность хроматина непосредственно во многих локусах, в том числе в локусах Zeb1 и Zeb2. Белки Zeb, в свою очередь, поддерживают недоступный хроматин во многих локусах, включая те, которые кодируют несколько других факторов транскрипции (например, Grhl2), каскадируя в дальнейшие нижестоящие мишени TF, которые регулирует Grlh3 (например, Ovol1). Дефицит Runx1 приводит к потере экспрессии белка Zeb и, как следствие, к обеспечению доступности и экспрессии Zeb-репрессированных генов, включая дополнительные активаторы транскрипции, такие как Grhl2 , Ovol1 и Klf2 (рис. 6), что в конечном итоге приводит к широкому распространению геномов. широкие изменения в доступности и транскрипции хроматина.

Интересно, что эти широкие эффекты на доступность хроматина и транскрипцию происходят несмотря на присутствие Runx2 в этих клетках. Runx2 остается связанным с большинством сайтов, иммунопреципитированных с помощью Runx1, включая недоступный хроматин, но неспособен компенсировать потерю Runx1 и поддерживать доступность хроматина [20]. Молекулярный механизм, лежащий в основе специфической способности Runx1 поддерживать доступность хроматина рядом с его генами-мишенями, остается исследуемым.

Помимо облегчения транскрипции за счет повышения доступности, TF могут регулировать транскрипцию путем привлечения дополнительных факторов или путем внесения вклада в активность предварительно собранных комплексов.В клетках mK4 Runx1, по-видимому, в значительной степени действует, поддерживая доступность хроматина для других TF и ​​поддерживая экспрессию репрессоров Zeb для предотвращения реакции множества других сайтов на их регуляторы. Обогащение подавляющими генами рядом с Runx1-зависимым ATAC-seq больше, чем наблюдаемое для Runx1 ChIP, это указывает на то, что влияние на доступность распространяется по регионам хроматина за пределы сайтов, непосредственно связанных с Runx1. Это повышает вероятность того, что Runx1 может играть дополнительную роль в облегчении загрузки других TF через открытие или поддержание доступности энхансера, чтобы обеспечить полную транскрипционную активацию его генов-мишеней и интеграцию с другими сигнальными путями, как было описано для других факторы транскрипции [42,43].Будет интересно определить, играет ли Runx1 роль обобщенного главного регулятора, контролирующего активность др. Сигнальных путей посредством модуляции доступности хроматина.

Роль Runx1 в развитии и заболевании почек широко не исследовалась. Клетки mK4, используемые в этом исследовании, происходят из метанефрической мезенхимы, которая содержит все предшественники нефронов, которые образуют почки млекопитающих посредством перехода от мезенхимы к эпителию. Runx1 регулирует EMT в др. Тканях [44–47].Хотя роль Runx1 во время развития почек неизвестна, он активируется в почках во время повреждения и восстановления, где он может вносить вклад в несколько болезненных процессов [23,48–51], включая рак [52,53], в которых он может взаимодействовать с Runx2 [54], чтобы управлять EMT, связанным с худшими результатами. Глубокие последствия потери Runx1 для транскриптома mK4 указывают на то, что дальнейшее определение его роли в почках может быть оправдано.

Открытие того, что увеличение доступности хроматина в клетках Runx1KO в значительной степени отражает потерю активности репрессорного белка Zeb, предполагает, что функции Runx1 «репрессора» могут выполняться Zeb во многих клетках и тканях, где для экспрессии Zeb требуется Runx1.Это может отражать недооцененное и широко распространенное сотрудничество между этими белками. Соответственно, изучение общедоступных данных функциональной геномики показало, что связанный с Runx1 энхансер Zeb1, который мы идентифицировали в клетках mK4, доступен (т.е. гиперчувствителен к ДНКазе) в других тканях, включая несколько линий гемопоэтических клеток (таблица S4), а также связывается с Runx1 в AML. Более того, усиление экспрессии Zeb может иметь отношение не только к роли Runx1 в AML, но также может вносить вклад в злокачественные новообразования твердых органов, где белки Zeb являются критическими индукторами EMT.В соответствии с этой гипотезой, совместная экспрессия Runx1 и Zeb2 в циркулирующих опухолевых клетках, как было показано, значительно коррелирует с рецидивом рака [55].

В совокупности наши данные указывают на то, что потеря Runx1 вызывает широко распространенные геномные и транскрипционные изменения посредством каскада прямых и непрямых секвенций с участием Zeb перед множественными репрессорами и активаторами транскрипции и выявляют ключевых членов этой сложной сети взаимодействующих TFs. Опосредование репрессии косвенно через активацию репрессоров широко распространено (например,g., повышающая регуляция Hes / Hey с помощью Notch) и, вероятно, будет включать дополнительные репрессоры, обнаруживаемые с помощью анализа обогащения мотивов исчезающих пиков ATAC-seq в различных генетических моделях и клеточных контекстах.

Материалы и методы

Культура ткани

Клетки mK4 и Runx1KO выращивали в среде DMEM с добавлением 10% FBS, L-глутамина, пенициллина / стрептомицина и пирувата натрия. Клетки трансфицировали липофектамином 2000 (Invitrogen) в соответствии с инструкциями производителя.

Генерация ячеек Runx1KO или ZebDKO

e использовал линию клеток mK4 в качестве нашей контрольной линии клеток, как описано в [21]. Из контрольной клеточной линии мы создали подлинии, которые не экспрессируют Runx1, используя направляющие РНК (gRNAs) в векторах px458 и px459 CRISPR / Cas9, чтобы удалить третий экзон Runx1, содержащий стартовый кодон, используемый в клетках mK4. Клетки ZebDKO были созданы аналогичным образом с использованием гРНК, нацеленных на второй экзон Zeb1 и первый экзон Zeb2, которые содержат стартовые кодоны этих генов.Последовательности нацеливания были созданы с помощью метода и инструментов, описанных в [56]. Затем эти клетки трансфицировали липофектамином 2000 (Invitrogen) в соответствии с инструкциями производителя. Клетки подвергали селекции пуромицином 1 мкг / мл в течение двух дней. Последующие клоны отбирали примерно через неделю с использованием дисков для клонирования, размножали и проверяли на делецию экзона 3 с помощью ПЦР и на потерю экспрессии белка Runx1 с помощью вестерн-блоттинга. Клоны ZebDKO подвергали скринингу с помощью ПЦР на целевые экзоны и Вестерн-блоттинга на Zeb1 на экспрессию белка.

Вестерн-блот

Конфлюэнтных контрольных клеток или клеток Runx1KO mK4 собирали в 100 мкл RIPA-DOC с ингибиторами протеаз плюс 100 мкл 2X буфера для образцов. Образцы белка обрабатывали на 7% полиакриламидных гелях, а затем переносили в PVDF. Использовались следующие первичные антитела: Runx1 (Cell Signaling # 8529), Runx2 (Cell Signaling # 8486), Runx3 (Cell Signaling # 9647), Zeb1 (Bethyl # a301-922a) и бета-актин (Sigma # A5441). Указанные антитела применяли в разведении 1: 1000 (за исключением бета-актина, который использовался в соотношении 1: 5000) в 5% молоке в PBST в течение ночи при 4 градусах, а после трехкратной промывки в PBST вторичные антитела применяли в разведении 1: 5000. в 5% молоке в PBST при комнатной температуре в течение 1 часа.Сигнал вестерн-блоттинга детектировали с использованием реагента Thermofisher Supersignal Femto ECL в соответствии с протоколом производителя и отображали с помощью системы визуализации Bio Rad Chemidoc MP.

РНК-последовательность

контрольных клеток mK4, Runx1KO и ZebDKO культивировали в трех экземплярах в стандартных средах mK4 (DMEM плюс 10% FBS, 2% L-глутамин, 1% Pen / Strep и 1% пируват натрия) на 12-луночных планшетах почти до слияния. Клетки удаляли с планшета с трипсином, который затем инактивировали с использованием среды, кондиционированной mK4, для предотвращения эффекта питания от свежей среды, активирующей сигнальные пути.РНК собирали с использованием набора Invitrogen’s Purelink RNA Mini в соответствии с инструкциями производителя. РНК-секвенирование на выделенной полиА РНК было выполнено ядром секвенирования CCHMC для получения более 20 миллионов считываний на образец.

RT-qPCR

Биологические образцы РНК в трех экземплярах были преобразованы в кДНК с использованием обратной транскриптазы Superscript II от Invitrogen в соответствии с протоколом производителя. КДНК разбавляли до 40 нг / мкл, и 5 мкл каждого образца добавляли в каждую реакцию RT-qPCR, которая была амплифицирована с использованием iTaq Universal SYBR Green Supermix от Bio-Rad и считывалась в системе для ПЦР в реальном времени StepOnePlus от Applied Biosystems.Уровни экспрессии генов были нормализованы к Gapdh, и изменения были определены относительно контрольных клеток со значимостью, рассчитанной с использованием t-критерия Стьюдента.

ATAC-seq

экспериментов ATAC-seq проводили на контрольных клетках mK4 и клетках Runx1KO в трех повторностях. Эксперименты проводились в соответствии с протоколом, разработанным Kaestner Lab [57]. Tn5, использованный в эксперименте, был приготовлен по методике, изложенной в [58]. Очистку библиотечного препарата проводили в соответствии с [59].

ЧИП-seq

Control и Runx1KO mK4 выращивали на 10-сантиметровых планшетах в трех экземплярах до почти слияния и удаляли с планшета с использованием трипсина, который был инактивирован кондиционированной средой. Подсчитывали отдельные клетки и использовали 10 ⁶ клеток для получения лизатов ChIP. Клетки инкубировали в сшивающем растворе (1% формальдегид, 5 мМ HEPES [pH 8,0], 10 мМ хлорид натрия, 0,1 мМ EDTA и 0,05 мМ EGTA в культуральной среде RPMI с 10% FBS) и помещали в ротатор для пробирок при комнатной температуре. на 10 мин.Чтобы остановить сшивание, добавляли глицин до конечной концентрации 0,125 М и снова помещали пробирки на ротатор при комнатной температуре на 5 мин. Клетки дважды промывали ледяным PBS, ресуспендировали в буфере для лизиса 1 (50 мМ HEPES [pH 8,0], 140 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА, 10% глицерина, 0,25% тритона X-100 и 0,5% NP-40). и поместили на ротатор для пробирок при 4 ° C на 10 минут. Ядра собирали после центрифугирования при 10000 g в течение 5 мин, ресуспендировали в буфере для лизиса 2 (10 мМ Трис-HCl [pH 8,0], 1 мМ ЭДТА, 200 мМ NaCl и 0.5 мМ EGTA) и помещали на ротатор для пробирок при комнатной температуре на 10 мин. Ядра снова собирали центрифугированием при 10 000 g в течение 5 минут. К обоим буферам для лизиса добавляли ингибиторы протеазы и фосфатазы. Затем ядра ресуспендировали в буфере для обработки ультразвуком (10 мМ Трис [pH 8,0], 1 мМ EDTA и 0,1% SDS). Сфокусированный ультразвуковой аппарат S220 (COVARIS) использовали для сдвига хроматина (фрагменты от 150 до 500 п.н.) с 10% рабочим циклом, 175 пиковой мощностью и 200 импульсами за цикл в течение 7 минут. Часть обработанного ультразвуком хроматина обрабатывали на агарозном геле для проверки размеров фрагментов.Срезанный хроматин предварительно очищали 20 мкл Dynabeads Protein A (Life Technologies) при 4 ° C в течение 1 часа.

Иммунопреципитацию комплексов Runx-хроматин проводили с помощью компактной автоматизированной системы SX-8X IP-STAR (Diagenode). Гранулы, конъюгированные с антителами против Runx1 (кроличье мАт № 8529, Cell Signaling) или Runx2 (кроличье мАт № 8486, Cell Signaling), инкубировали с предварительно очищенным хроматином при 4 ° C в течение 8 часов. Затем шарики последовательно промывали промывочным буфером 1 (50 мМ трис-HCl [pH 7.5], 150 мМ NaCl, 1 мМ EDTA, 0,1% SDS, 0,1% NaDOC и 1% Triton X-100), промывочный буфер 2 (50 мМ трис-HCl [pH 7,5], 400 мМ NaCl, 1 мМ EDTA, 0,1% SDS, 0,1% NaDOC и 1% Triton X-100), промывочный буфер 3 (2 мМ EDTA, 50 мМ Tris-HCl [pH 7,5] и 0,2% натриевая соль саркозила) и промывочный буфер 4 (10 мМ Tris -HCl [pH 7,5], 1 мМ EDTA и 0,2% Triton X-100). Наконец, шарики ресуспендировали в 10 мМ Трис-HCl (pH 7,5) и использовали для приготовления библиотек с помощью чипирования [60].

Обработка данных функциональной геномики

чтения RNA-seq, ATAC-seq и ChIP-seq (в формате FASTQ) сначала подвергали контролю качества с помощью FastQC (v0.11.7) (значения параметров: —extract -o output_fastqc -f R1.fastq.gz) [61]. Последовательности адаптеров были удалены с помощью Trim Galore (v0.4.2) (настройки параметров: -o папка — путь_к_cutadapt cutadapt — парный R1.fastq.gz R2.fastq.gz) [62], сценарий оболочки, который запускает cutadapt (v1.9.1) [63] для удаления последовательностей адаптеров из считываемых данных. Считывания с контролем качества были сопоставлены с эталонной версией генома мыши NCBI37 / mm9 с использованием STAR v2.6.1e [64]. Повторные чтения удалялись с помощью программы sambamba v0.6.8 (настройки параметров: -q markdup -r -t 8 trimmed.bam trimmed_dedup.bam) [65]. Аннотации генов для анализа RNA-seq были загружены из UCSC Table Browser [66] для генома NCBI37 / mm9 в формате GTF. Ненормализованную экспрессию генов оценивали путем подсчета признаков для каждого гена, определенного в базе данных RefSeq NCBI [67]. Подсчет чтения производился с помощью программы featureCounts v1.6.2 из пакета Rsubread [68]. Различную экспрессию генов между группами образцов оценивали с помощью пакета R DESeq2 v1.26.0 [69]. Дифференциально экспрессируемые гены определяли с использованием порогового значения 0.3 (на 30% больше выражения) и отсечка FDR 0,05. Последующие сравнения с пиками ChIP-seq и ATAC-seq были сосредоточены на генах, отображающих более чем 2-кратное изменение экспрессии. Для тепловых карт мы использовали логарифм (основание 10) нормализованных подсчетов, выраженных в транскриптах на миллион (TPM). Графики были созданы с использованием базовой графики R, а также с помощью пакета ggplot2 [70].

данных ATAC-seq и ChIP-seq были обработаны с использованием следующих шагов. Пики вызывались с помощью MACS2 v2.1.2 (настройки параметров: callpeak -g mm -q 0.01 — широкий -t trimmed_dedup.bam -f BAM -n trimmed_dedup_peaks) [71]. Конкретные пики ChIP были идентифицированы с помощью пика MACS2, вызывающего объединенные реплики чтения и удаления пиков, которые перекрываются с неспецифическими фоновыми пиками, вызываемыми в Runx1 ChIP в ячейках Runx1KO. Пики, общие для экспериментов (т.е. пики, общие для повторений или для разных обработок / условий), были идентифицированы как пики с перекрытием 50% или более с помощью BEDtools v2.27.0 [72]. Окончательные наборы пиков для каждого условия получали, требуя, чтобы пики присутствовали по крайней мере в двух из трех биологических повторов.При сравнении различных обработок или условий перекрытие пиков между любым из трех повторов при любом лечении / условиях считалось общим пиком между обработками / условиями. Конечные пики, первоначально в формате BED, были преобразованы в формат Gene Transfer Format (GTF), чтобы обеспечить быстрый подсчет считываний под пиками с помощью программы featureCounts v1.6.2 (пакет Rsubread) (настройки параметров: featureCounts — ignoreDup -M -t peak -s 0 -O -T 4 -a common_peaks.gtf -o output_counts.txt trimmed_dedup.бац). Результирующая матрица необработанных подсчетов была нормализована для всех типов экспериментов по транскриптам на миллион значений (TPM). Анализ обогащения мотивов сайта связывания TF проводили с использованием программного пакета HOMER [73], который был модифицирован для использования системы подсчета по логарифмической базе 2 и набора мотивов мыши, содержащихся в сборке 2.0 базы данных Cis-BP [25].

Расширенный анализ функциональных наборов геномных данных: мы использовали алгоритм RELI (32) для выявления геномных особенностей (события связывания TF, гистоновые метки, пики ATAC-seq и т. Д.)), которые существенно пересекаются с нашими наборами данных функциональной геномики. В качестве входных данных RELI берет геномные координаты пиков из входного набора данных. Затем RELI систематически пересекает эти координаты с каждым членом большой коллекции наборов данных функциональной геномики. Подсчитывается количество областей ввода, перекрывающих пики каждого набора данных. Затем значение p, описывающее значимость перекрытия каждого набора данных, оценивается с использованием процедуры, основанной на моделировании, в которой пики из входного набора данных случайным образом перераспределяются в открытых областях хроматина в клетках мыши.(Эти открытые области хроматина были созданы из объединенного набора общедоступных наборов данных ДНКазы-seq мыши, полученных с помощью мыши ENCODE [74]. Распределение ожидаемых значений перекрытия создается из 2000 итераций этого процесса случайной выборки. Распределение ожидаемого перекрытия Значения из рандомизированных данных напоминают нормальное распределение и, таким образом, могут использоваться для генерации Z-балла и соответствующего p-значения, оценивающего значимость наблюдаемого количества входных областей, которые перекрывают каждый набор данных.

Вспомогательная информация

S2 Рис.

A) Тепловые карты чтения Runx1 и Runx2 ChIP, сопоставленные с пиками Runx1 ChIP, показывающие воспроизводимость реплик ChIP. B) Корреляционная матрица для Runx1 (слева) и Runx2 (справа) ChIP, показывающая сильную корреляцию между образцами C) Гистограммы обогащения мотивов фактора транскрипции -log10 p-значений в Runx1 ChIP в клетках mK4 и Runx2 ChIP в клетках mK4 и Runx1KO, которые подтверждают сильнейшее обогащение мотивов Runx.

https: // doi.org / 10.1371 / journal.pgen.1009574.s002

(PDF)

S3 Рис.

A) Тепловая карта Z-значений отдельных образцов ATAC-seq из клеток mK4 или Runx1KO в пиках ATAC-seq, зависимых от Runx1 или Runx1KO, показывающих воспроизводимость сигнала ATAC-seq в повторах и различия между клетками mK4 и Runx1KO. Б) Диаграммы Венна, отображающие перекрытие пиков ATAC-seq между повторами. C) Тепловые карты Runx1 или Runx2 ChIP, показывающие связывание Runx1 как с Runx1-независимыми, так и с Runx1-зависимыми пиками ATAC-seq, но очень слабое связывание с пиками ATAC-seq, индуцированными Runx1KO.D) Гистограммы значений -log10 p обогащения мотивов в 3 различных классах пиков ATAC-seq. Runx1-независимые пики ATAC-seq обогащены AP-1 и Ctcf-мотивами, Runx1-зависимые ATAC-seq обогащены AP-1 и Runx-мотивами, а Runx1KO-Induced ATAC-seq отображает обогащение AP-1, Zeb и Ctcf мотивы.

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009574.s003

(PDF)

S4 Рис.

A) Геномные снимки Runx1 и Runx2 ChIP и ATAC-seq вокруг генов с пониженной регуляцией Runx1KO Twist2 , Tnc , Zfp810 , Inhbb , 9055fb 907 и Lep1 907 Связывание Runx1 и Runx2 с пиками ATAC-seq, которые теряются в ячейках Runx1KO.B) Тепловые карты Runx1 или Runx2 ChIP на Runx1-зависимых пиках ATAC-seq, разделенных на те сайты, которые сохраняют связывание Runx2 в клетках Runx1KO или сайты, где связывание Runx2 потеряно. Runx1-зависимая ATAC-seq, которая теряет связывание Runx2 в клетках Runx1KO, не может обогатиться для генов, которые подавляются в клетках Runx1KO в большей степени, чем Runx1-зависимая ATAC-seq, которая сохраняет связывание Runx2.

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009574.s004

(PDF)

S5 Рис.

A) Геномные снимки вышеупомянутых генов-мишеней Runx1, показывающие воспроизводимость сигнала во всех трех повторах для ATAC-seq, Runx1-ChIP и Runx2-ChIP.Б) Дополнительные примеры, не обсуждаемые в тексте.

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009574.s005

(PDF)

S6 Рис.

A) График, демонстрирующий обогащение мотива фактора транскрипции (-log10 p-значение) в пиках ATAC-seq, зависимых от Runx1 по сравнению с Runx1KO-индуцированными, который показывает, что мотивы AP-1 сильно обогащены обоими, но Zeb, Ctcf, Klf , и мотивы Grainyhead специфичны для пиков ATAC-seq, индуцированных Runx1KO, тогда как мотивы Runx1 обогащены только пиками Runx1-зависимых ATAC-seq.B) Геномный снимок Zeb1, который показывает потерю сигнала ATAC-seq в TSS, который теряется в клетках Runx1KO, что согласуется с потерей экспрессии в этих клетках. C) График нормализованных считываний РНК-seq, показывающий повышающую регуляцию Pard6b в клетках Runx1KO, как ожидалось для гена, репрессированного Zeb. D) Анализ RT-qPCR, подтверждающий резкое подавление как Zeb1, так и Zeb2 и активацию Pard6b в клетках Runx1KO, но отсутствие различий для неродственного гена Hes1.

https: // doi.org / 10.1371 / journal.pgen.1009574.s006

(PDF)

S7 Рис.

A) RT-qPCR показывает, что клетки Runx1KO и ZebDKO имеют аналогичную повышающую регуляцию Pard6b , Grhl2 и Itgb4 . B) Геномные снимки Pard6b , Grhl2 и Itgb4 , демонстрирующие раскрытие хроматина потенциальных энхансеров, содержащих мотивы Zeb, во всех трех репликациях ATAC-seq (красные прямоугольники) из клеток Runx1KO. C) Тепловая карта генов, демонстрирующих более чем 2-кратное изменение экспрессии в клетках Runx1KO и ZebDKO по сравнению с контрольными клетками mK4.D) Анализ GSEA, показывающий обогащение генов, которые были увеличены более чем в 2 раза в клетках Runx1KO в наборе генов, которые были увеличены более чем в 2 раза в клетках ZebDKO, как и ожидалось, учитывая известную репрессивную функцию белков Zeb.

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009574.s007

(PDF)

S1 Таблица. Эта таблица представляет собой файл Excel, содержащий данные экспрессии RNA-seq, представленные в виде транскриптов на миллион (TPM), гены демонстрируют более чем 2-кратное изменение экспрессии с FDR менее 0.05 между Runx1KO и контрольными или ZebDKO и контрольными клетками, а также гипергеометрическое сравнение изменений экспрессии генов с генами, связанными с пиками ChIP-seq или ATAC-seq.

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009574.s008

(XLSX)

Благодарности

Доктору Эрику Бранскиллу, Хоуп Роуден, Карми Форни, Кевину Эрнсту и доктору Сяотин Чен за критические обсуждения, техническую помощь, организацию и / или вычислительную помощь в создании этой рукописи.

Список литературы

1. 1. Lambert SA, Jolma A, Campitelli LF, Das PK, Yin Y, Albu M и др. Факторы транскрипции человека. Клетка. 2018; 175 (2): 598–599. pmid: 302
2. 2. Ли Т.И., Янг Р.А. Регуляция транскрипции и ее неправильная регуляция при болезни. Клетка. 2013. 152 (6): 1237–1251. pmid: 23498934
3. 3. Реннерт Дж., Коффман Дж. А., Мушегян А. Р., Робертсон А. Дж.. Эволюция генов Runx I. Сравнительное исследование последовательностей филогенетически разнообразных модельных организмов.BMC Evol Biol. 2003; 3: 4. pmid: 12659662
4. 4. Mevel R, Draper JE, Lie ALM, Kouskoff V, Lacaud G. Факторы транскрипции RUNX: организаторы развития. Разработка. 2019; 146 (17). pmid: 31488508
5. 5. Ито Й, Бэ СК, Чуанг ЛС. Семейство RUNX: регуляторы развития при раке. Нат Рев Рак. 2015; 15 (2): 81–95. pmid: 25592647
6. 6. de Bruijn M, Dzierzak E. Факторы транскрипции Runx в развитии и функции дефинитивной системы кроветворения.Кровь. 2017; 129 (15): 2061–2069. pmid: 28179276
7. 7. Сео В., Таниучи И. Роль белков семейства RUNX в развитии иммунных клеток. Mol Cells. 2020; 43 (2): 107–113. pmid: 31926543
8. 8. Osorio KM, Lee SE, McDermitt DJ, Waghmare SK, Zhang YV, Woo HN и др. Runx1 модулирует активацию стволовых клеток волосяных фолликулов, вызванную развитием, но не вызванную повреждениями. Разработка. 2008. 135 (6): 1059–1068. pmid: 18256199
9. 9. Glotzer DJ, Zelzer E, Olsen BR.Нарушение развития кожи и волосяных фолликулов у мышей с дефицитом Runx2. Dev Biol. 2008. 315 (2): 459–473. pmid: 18262513
10. 10. Hoi CS, Lee SE, Lu SY, McDermitt DJ, Osorio KM, Piskun CM и др. Runx1 напрямую способствует пролиферации стволовых клеток волосяных фолликулов и образованию эпителиальных опухолей в коже мышей. Mol Cell Biol. 2010. 30 (10): 2518–2536. pmid: 20308320
11. 11. Zhang Y, Hassan MQ, Li ZY, Stein JL, Lian JB, van Wijnen AJ, et al. Сложные генные регуляторные сети белков спираль-петля-спираль (HLH) поддерживают регуляцию генов, связанных с костной тканью, во время дифференцировки остеобластов.J Cell Biochem. 2008. 105 (2): 487–496. pmid: 18655182
12. 12. Сьерра О.Л., Ченг С.Л., Лоуи А.П., Чарльтон-Качигиан Н., Таулер Д.А. MINT, взаимодействующая с Msx2 мишень ядерного матрикса, усиливает Runx2-зависимую активацию элемента ответа фактора роста фибробластов остеокальцина. J Biol Chem. 2004. 279 (31): 32913–32923. pmid: 15131132
13. 13. Комори Т. Runx2, индуктор дифференцировки остеобластов и хондроцитов. Histochem Cell Biol. 2018; 149 (4): 313–323. pmid: 29356961
14. 14.Ван Л., Гурал А., Сунь XJ, Чжао X, Перна Ф., Хуанг Г. и др. Лейкемогенность AML1-ETO зависит от сайт-специфического ацетилирования лизина. Наука (Нью-Йорк, Нью-Йорк). 2011. 333 (6043): 765–769. pmid: 21764752
15. 15. Ли Дж. У., Ким Д. М., Чан Дж. В., Пак Т. Г., Сон Ш., Ли Ю. С. и др. RUNX3 регулирует зависимую от клеточного цикла динамику хроматина, действуя как пионерный фактор точки рестрикции. Nat Commun. 2019; 10 (1): 1897. pmid: 31015486
16. 16. Гояма С., Хуанг Дж., Курокава М., Маллой Дж.Посттрансляционные модификации RUNX1 как потенциальные противораковые мишени. Онкоген. 2015; 34 (27): 3483–3492. pmid: 25263451
17. 17. Джамбра В., Дженкинс С.Р., Ван Х., Лам Ш., Шевчук О.О., Немировский О. и др. NOTCh2 способствует инициированию Т-клеточной лейкемии активности посредством RUNX-опосредованной регуляции PKC-тета и активных форм кислорода. Nat Med. 2012. 18 (11): 1693–1698. pmid: 23086478
18. 18. Терриенте-Феликс А., Ли Дж., Коллинз С., Маллиган А., Рики И., Бернард Ф. и др. Notch сотрудничает с Lozenge / Runx, чтобы заблокировать гемоциты в программе дифференцировки.Разработка. 2013; 140 (4): 926–937. pmid: 23325760
19. 19. Куех Х.Й., Юи М.А., Нг К.К., Пис С.С., Чжан Дж.А., Дамле С.С. и др. Асинхронное комбинаторное действие четырех регуляторных факторов активирует Bcl11b для фиксации Т-клеток. Nat Immunol. 2016; 17 (8): 956–965. pmid: 27376470
20. 20. Lichtinger M, Hoogenkamp M, Krysinska H, ​​Ingram R, Bonifer C. Регулирование хроматина с помощью RUNX1. Blood Cells Mol Dis. 2010. 44 (4): 287–290. pmid: 20194037
21. 21. Валериус М.Т., Паттерсон Л.Т., Витте Д.П., Поттер С.С.Микроматричный анализ новых клеточных линий, представляющих две стадии дифференцировки метанефрической мезенхимы. Mech Dev. 2002. 110 (1–2): 151–164. pmid: 11744376
22. 22. Hass MR, Liow HH, Chen X, Sharma A, Inoue YU, Inoue T. и др. SpDamID: маркировка ДНК, связанной белковыми комплексами, позволяет идентифицировать энхансеры, реагирующие на димер Notch. Mol Cell. 2015. 59 (4): 685–697. pmid: 26257285
23. 23. Чжоу Т., Ло М., Цай В., Чжоу С., Фэн Д., Сюй Ц. и др. Связанный с Runt транскрипционный фактор 1 (RUNX1) способствует индуцированному TGF-бета переходу почечного канальцевого эпителия в мезенхиму (EMT) и почечному фиброзу через субъединицу PI3K p110delta.EBioMedicine. 2018; 31: 217–225. pmid: 29759484
24. 24. Авад С., Канкайнен М., Дюфва О., Хекман К.А., Поркка К., Мустйоки С. Мутации RUNX1 определяют сущность пациентов с хроническим миелоидным лейкозом в бластной фазе (BP-CML) с отчетливым фенотипом, транскрипционным профилем и уязвимостью к лекарствам. Кровь. 2018; 132 (Приложение 1): 4257–4257.
25. 25. Lambert SA, Yang AWH, Sasse A, Cowley G, Albu M, Caddick MX и др. Регрессия сходства предсказывает эволюцию специфичности последовательности фактора транскрипции.Нат Жене. 2019; 51 (6): 981–989. pmid: 31133749
26. 26. Pencovich N, Jaschek R, Tanay A, Groner Y. Динамические комбинаторные взаимодействия RUNX1 и взаимодействующих партнеров регулируют дифференцировку мегакариоцитов в моделях клеточных линий. Кровь. 2011; 117 (1): e1–14. pmid: 20959602
27. 27. Андерссон Р., Гебхард С., Мигель-Эскалада И., Копыто И., Борнхольдт Дж., Бойд М. и др. Атлас активных энхансеров для разных типов клеток и тканей человека. Природа. 2014; 507 (7493): 455–461. pmid: 24670763
28. 28.Квасниески JC, Fiore C, Chaudhari HG, Cohen BA. Высокопроизводительное функциональное тестирование прогнозов сегментации ENCODE. Genome Res. 2014. 24 (10): 1595–1602. pmid: 25035418
29. 29. Бидди С.К., Джон С., Сабо П.Дж., Турман Р.Е., Джонсон Т.А., Шильц Р.Л. и др. Фактор транскрипции AP1 усиливает доступность хроматина и связывание с рецептором глюкокортикоидов. Mol Cell. 2011. 43 (1): 145–155. pmid: 21726817
30. 30. Vierbuchen T, Ling E, Cowley CJ, Couch CH, Wang X, Harmin DA, et al.Факторы транскрипции AP-1 и комплекс BAF опосредуют выбор сигнально-зависимого усилителя. Mol Cell. 2017; 68 (6): 1067–1082 e1012. pmid: 29272704
31. 31. Маклин С.Ю., Бристор Д., Хиллер М., Кларк С.Л., Шаар Б.Т., Лоу CB и др. GREAT улучшает функциональную интерпретацию цис-регуляторных регионов. Nat Biotechnol. 2010. 28 (5): 495–501. pmid: 20436461
32. 32. Харли Дж. Б., Чен Х, Пуджато М., Миллер Д., Мэддокс А., Форни С. и др. Факторы транскрипции действуют в локусах болезни, при этом EBNA2 участвует в аутоиммунитете.Генетика природы. 2018; 50 (5): 699–707. pmid: 29662164
33. 33. Chen CL, Broom DC, Liu Y, de Nooij JC, Li Z, Cen C и др. Runx1 определяет фенотип ноцицептивного сенсорного нейрона и необходим при термической и невропатической боли. Нейрон. 2006. 49 (3): 365–377. pmid: 16446141
34. 34. Луо В., Викрамасингх С.Р., Савитт Дж. М., Гриффин Дж. В., Доусон TM, Джинти Д.Д. Иерархический каскад передачи сигналов NGF контролирует Ret-зависимые и Ret-независимые события во время развития непептидергических нейронов DRG.Нейрон. 2007. 54 (5): 739–754. pmid: 17553423
35. 35. Эрнсбергер У. Роль передачи сигналов лиганда семейства GDNF в дифференцировке нейронов ганглия симпатических и дорсальных корешков. Cell Tissue Res. 2008. 333 (3): 353–371. pmid: 18629541
36. 36. Park BY, Hong CS, Weaver JR, Rosocha EM, Saint-Jeannet JP. Xaml1 / Runx1 требуется для спецификации сенсорных нейронов Рохона-Бороды у Xenopus. Биология развития. 2012; 362 (1): 65–75. pmid: 22173066
37. 37.Rouillard AD, Gundersen GW, Fernandez NF, Wang Z, Monteiro CD, McDermott MG, et al. Гармонизома: набор обработанных наборов данных, собранных, чтобы служить и добывать знания о генах и белках. База данных: журнал биологических баз данных и курирования. 2016; 2016. pmid: 27374120
38. 38. Stock M, Schafer H, Fliegauf M, Otto F. Идентификация новых генов костно-специфического фактора транскрипции Runx2. J Bone Miner Res. 2004. 19 (6): 959–972. pmid: 151

39. 39.Чипли Б., Фаррис Дж., Денвир Дж., Форд Х.Л., Фриш С.М. Эпителиально-мезенхимальный переход и подавление опухоли контролируются обратной петлей между ZEB1 и Grainyhead-like-2. Cancer Res. 2013. 73 (20): 6299–6309. pmid: 23943797
40. 40. Бреттингем-Мур KH, Таберлей ПК, Холлоуэй AF. Взаимодействие между факторами транскрипции и эпигеномом: понимание роли RUNX1 в лейкемии. Фронт Иммунол. 2015; 6: 499. pmid: 26483790
41. 41. Со В., Танака Х., Миямото К., Леванон Д., Гронер Й., Таниучи И.Роль опосредованной мотивом VWRPY репрессии гена белками Runx во время развития Т-клеток. Immunol Cell Biol. 2012. 90 (8): 827–830. pmid: 22370763
42. 42. ван Бакель Х. Взаимодействие факторов транскрипции с хроматином. Субклеточная биохимия. 2011; 52: 223–259. pmid: 21557086
43. 43. Friman ET, Deluz C, Meireles-Filho AC, Govindan S, Gardeux V, Deplancke B и др. Динамическое регулирование доступности хроматина с помощью факторов транскрипции плюрипотентности в клеточном цикле.eLife. 2019; 8. pmid: 31794382
44. 44. Хонг Д., Мессье Т.Л., Тай С.Е., Добсон Дж. Р., Фриц А. Дж., Сикора К. Р. и др. Runx1 стабилизирует фенотип эпителиальных клеток молочных желез и предотвращает переход эпителия в мезенхиму. Oncotarget. 2017; 8 (11): 17610–17627. pmid: 28407681
45. 45. Вануденхов Дж. Дж., Медина Р., Гуле П. Н., Лиан Дж. Б., Штейн Дж. Л., Заиди С. К. и др. Преждевременная фенотипическая экспрессия транскрипционного фактора на раннем этапе развития. J Cell Biochem. 2017; 118 (5): 953–958.pmid: 275
46. 46. Монтейро Р., Пинейро П., Джозеф Н., Петеркин Т., Кот Дж., Репапи Е. и др. Трансформирующий фактор роста бета управляет программированием гемогенного эндотелия и переходом на гемопоэтические стволовые клетки. Клетка развития. 2016; 38 (4): 358–370. pmid: 27499523
47. 47. Wang CQ, Mok MM, Yokomizo T., Tergaonkar V, Osato M. Гены семейства Runx в динамике тканевых стволовых клеток. Adv Exp Med Biol. 2017; 962: 117–138. pmid: 28299655
48. 48. Галичон П.Эпителиальная передача сигналов через путь RUNX1 / AKT: новая терапевтическая мишень при фиброзе почек. EBioMedicine. 2018; 32: 5. pmid: 29885863
49. 49. Ху Ф, Цзэн В., Лю Х. Сигнатура гена прогноза выживаемости при почечно-клеточной карциноме почки с помощью анализа данных с множеством омиков. Int J Mol Sci. 2019; 20 (22). pmid: 31739630
50. 50. Formica C, Malas T, Balog J, Verburg L, t Hoen PAC, Peters DJM. Характеристика профилей факторов транскрипции при поликистозной болезни почек (PKD): идентификация и проверка STAT3 и RUNX1 в ответе на повреждение / восстановление и прогрессировании PKD.J Mol Med (Берл). 2019; 97 (12): 1643–1656. pmid: 31773180
51. 51. Cheng L, Tu C, Min Y, He D, Wan S, Xiong F. MiR-194 нацелен на путь Runx1 / Akt для уменьшения почечного фиброза у мышей с односторонней обструкцией мочеточника. Int Urol Nephrol. 2020; 52 (9): 1801–1808. pmid: 32661617
52. 52. Руни Н., Мейсон С.М., Макдональд Л., Дабриц Дж.Х.М., Кэмпбелл К.Дж., Хедли А. и др. RUNX1 является движущей силой почечно-клеточной карциномы, коррелирующей с клиническим исходом. Cancer Res. 2020; 80 (11): 2325–2339.pmid: 32156779
53. 53. Xiong Z, Yu H, Ding Y, Feng C, Wei H, Tao S и др. Секвенирование РНК выявляет повышенную регуляцию сигнатур гена RUNX1-RUNX1T1 в светлоклеточной почечно-клеточной карциноме. Biomed Res Int. 2014; 2014: 450621. pmid: 24783204
54. 54. Лю Б., Лю Дж., Ю Х, Ван С., Конг С. Фактор транскрипции RUNX2 регулирует эпителиально-мезенхимальный переход и прогрессирование почечно-клеточного рака. Отчеты онкологии. 2020; 43 (2): 609–616. pmid: 31894317
55. 55. Алонсо-Алконада Л., Муйнело-Ромай Л., Мадиссоо К., Диас-Лопес А., Кракстад С., Тровик Дж. И др.Молекулярное профилирование циркулирующих опухолевых клеток связывает пластичность с метастатическим процессом при раке эндометрия. Молочный рак. 2014; 13: 223. pmid: 25261936
56. 56. Haeussler M, Schonig K, Eckert H, Eschstruth A, Mianne J, Renaud JB и др. Оценка нецелевых и целевых алгоритмов подсчета баллов и интеграция в инструмент выбора направляющих РНК CRISPOR. Genome Biol. 2016; 17 (1): 148. pmid: 27380939
57. 57. Акерманн А.М., Ван З., Шуг Дж., Наджи А., Кестнер К.Х.Интеграция ATAC-seq и RNA-seq позволяет идентифицировать гены сигнатур альфа-клеток и бета-клеток человека. Mol Metab. 2016; 5 (3): 233–244. pmid: 26977395
58. 58. Buenrostro JD, Giresi PG, Zaba LC, Chang HY, Greenleaf WJ. Транспозиция нативного хроматина для быстрого и чувствительного эпигеномного профилирования открытого хроматина, ДНК-связывающих белков и положения нуклеосом. Нат методы. 2013; 10 (12): 1213–1218. pmid: 24097267
59. 59. Corces MR, Trevino AE, Hamilton EG, Greenside PG, Sinnott-Armstrong NA, Vesuna S и др.Усовершенствованный протокол ATAC-seq снижает фон и позволяет исследовать замороженные ткани. Природные методы. 2017; 14 (10): 959–962. pmid: 28846090
60. 60. Schmidl C, Rendeiro AF, Sheffield NC, Bock C. ChIPmentation: быстрая, надежная, малоинформативная ChIP-seq для гистонов и факторов транскрипции. Природные методы. 2015; 12 (10): 963–965. pmid: 26280331
61. 61. Калита К.А., Мойербрайлен Г.А., Браун С., Вен X, Лука Ф., Пике-Реги Р. QuASAR-MPRA: точный аллель-специфический анализ для массово параллельных анализов репортеров.Биоинформатика. 2018; 34 (5): 787–794. pmid: 288
62. 62. Гудвин С., Макферсон Дж. Д., Маккомби В. Р.. Достигнув совершеннолетия: десять лет технологиям секвенирования следующего поколения. Nat Rev Genet. 2016; 17 (6): 333–351. pmid: 27184599
63. 63. Bentley DR, Balasubramanian S, Swerdlow HP, Smith GP, Milton J, Brown CG и др. Точное секвенирование всего генома человека с использованием химии обратимых терминаторов. Природа. 2008. 456 (7218): 53–59. pmid: 18987734
64. 64. Добин А., Дэвис К.А., Шлезингер Ф., Дренкоу Дж., Залески С., Джа С. и др.STAR: сверхбыстрый универсальный выравниватель RNA-seq. Биоинформатика. 2013. 29 (1): 15–21. pmid: 23104886
65. 65. Тарасов А., Вилелла А.Дж., Куппен Э., Ниджман И.Дж., Принс П. Самбамба: быстрая обработка форматов выравнивания NGS. Биоинформатика. 2015; 31 (12): 2032–2034. pmid: 25697820
66. 66. Карольчик Д., Хинрикс А.С., Фьюри Т.С., Роскин К.М., Сугнет К.В., Хаусслер Д. и др. Инструмент поиска данных UCSC Table Browser. Nucleic Acids Res. 2004; 32 (выпуск базы данных): D493–496. pmid: 14681465
67. 67.О’Лири Н.А., Райт М.В., Бристер Дж. Р., Чиуфо С., Хаддад Д., Маквей Р. и др. База данных эталонных последовательностей (RefSeq) в NCBI: текущий статус, таксономическое расширение и функциональная аннотация. Nucleic Acids Res. 2016; 44 (D1): D733–745. pmid: 26553804
68. 68. Liao Y, Smyth GK, Shi W. Пакет R Rsubread проще, быстрее, дешевле и лучше для выравнивания и количественной оценки считываний секвенирования РНК. Nucleic Acids Res. 2019; 47 (8): e47. pmid: 30783653
69. 69. Любовь М.И., Хубер В., Андерс С.Умеренная оценка кратного изменения и дисперсии данных RNA-seq с помощью DESeq2. Genome Biol. 2014; 15 (12): 550. pmid: 25516281
70. 70. Уикхэм Х. ggplot2: Элегантная графика для анализа данных: Springer International Publishing; 2016.
71. 71. Zhang Y, Liu T, Meyer CA, Eeckhoute J, Johnson DS, Bernstein BE и др. Модельный анализ ChIP-Seq (MACS). Genome Biol. 2008; 9 (9): R137. pmid: 18798982
72. 72. Куинлан А.Р., Холл И.М. BEDTools: гибкий набор утилит для сравнения геномных характеристик.Биоинформатика. 2010. 26 (6): 841–842. pmid: 20110278
73. 73. Heinz S, Benner C, Spann N, Bertolino E, Lin YC, Laslo P и др. Простые комбинации факторов транскрипции, определяющих клонирование, активируют цис-регуляторные элементы, необходимые для идентичности макрофагов и В-клеток. Mol Cell. 2010. 38 (4): 576–589. pmid: 20513432
74. 74. Mouse EC, Stamatoyannopoulos JA, Снайдер М., Хардисон Р., Рен Б., Гингерас Т. и др. Энциклопедия элементов ДНК мыши (Mouse ENCODE). Genome Biol.2012; 13 (8): 418. pmid: 22889292