Мерс 120: Доступ с вашего IP-адреса временно ограничен — Авито

4. Пациент 2

Мужчина 28 лет, ординатор-ортопед, поступил в отделение неотложной помощи с четырехдневной историей лихорадки, генерализованной миалгии, головокружения и продуктивного кашля. Он сообщил историю контактов с подтвержденным случаем БВРС-КоВ. Он был помещен в изолированную палату в связи с острым вирусным заболеванием с бронхитом, и ему было начато поддерживающее и симптоматическое лечение азитромицином и осельтамивиром. Он был полностью обследован, и на 13 день после поступления ОТ-ПЦР на БВРС-КоВ дала положительный результат по респираторным секретам.С момента поступления его лихорадка никогда не снижалась, а дыхательные функции постепенно ухудшались из-за десатурации и потребности в добавках с высоким содержанием кислорода. На 4-й день после поступления его интубировали, искусственно вентилировали и перевели в отделение интенсивной терапии. В отделении интенсивной терапии у пациента было бурное течение с вторичной бактериальной пневмонией, при которой антибиотики были назначены полными курсами. В конце концов он поправился, экстубировал и перешел на пол. В полу потребовалась консультация невролога из-за слабости обеих ног и неспособности ходить с онемением и покалыванием при раздаче чулок.Его обследовали на всем протяжении, включая нейровизуализацию, анализ спинномозговой жидкости, исследования скорости нервной проводимости (NCV) и ЭМГ. МРТ всего позвоночника и анализ спинномозговой жидкости в норме. Исследования NCV показали низкую амплитуду при нормальной латентности и скорости проведения, особенно в нижней конечности, что указывает на аксональную полинейропатию, зависящую от длины. Окончательный диагноз — полинейропатия в критическом состоянии, осложняющая длительное пребывание в ОИТ. Он получал внутривенные иммуноглобулины 400 мг / кг ежедневно в течение пяти дней и тщательно контролировал его дыхательные функции.Он также ежедневно получал обширную физиотерапию и был отправлен домой через 40 дней после госпитализации. Через шесть месяцев его осмотрели в клинике, и состояние его здоровья постепенно улучшалось.

5. Обсуждение

Коронавирусы — это семейство оболочечных одноцепочечных вирусов с положительной РНК, которые преобладают у летучих мышей и могут поражать многие другие виды, включая человека. Название corona обозначает коронообразный вид поверхностных выступов вируса под электронным микроскопом.Они могут вызывать респираторные, желудочно-кишечные, печеночные и неврологические заболевания у различных видов [1]. Они сгруппированы в четыре разных рода: альфа, бета, гамма и дельта коронавирусы. Существует шесть типов коронавирусов, поражающих людей и, следовательно, называемых коронавирусами человека (HCoV): HCoV-229E, HCoV-OC43, HCoV-NL63, HCoV-HKU1, SARS-CoV и MERS-CoV (Таблица 1) [6 ]. Считается, что летучие мыши являются естественным резервуаром коронавирусов, а вирусы могут передаваться к человеку через промежуточный резервуар.Доказано, что эти вирусы обладают способностью преодолевать видовой барьер и заражать людей и других животных [7]. Заражение человека коронавирусами было в основном легким и безвредным, за исключением SARS-CoV и MERS-CoV, где они вызывают тяжелую заболеваемость и смертность. Среди коронавирусов человека HCoV-229E, HCoV-OC43, SARS-CoV и совсем недавно было доказано, что MERS-CoV связаны с неврологическими заболеваниями [4, 5, 8].

БВРС-КоВ впервые появился в сентябре 2012 года в Саудовской Аравии у 60-летнего мужчины, умершего от дыхательной и почечной недостаточности и полиорганного поражения [1]. Считается, что он произошел от летучих мышей и передан людям через верблюдов-верблюдов в качестве промежуточного хозяина. Верблюды-однодневки являются частью культуры и экономических ресурсов для многих бизнесменов и малообеспеченных граждан Саудовской Аравии. Хотя летучие мыши в большом количестве встречаются в Африке, Америке, Азии и Европе, они также были обнаружены в небольшом количестве в пещерах и горах Саудовской Аравии [9].Болезнь у верблюдов может протекать так же, как простуда. Однако это может привести к катастрофическим последствиям для человека. У людей вирус вызывает заболевание нижних дыхательных путей и в тяжелых случаях может прогрессировать до ОРДС, полиорганной недостаточности и смерти. Пожилые люди и пациенты с множественными сопутствующими заболеваниями оказываются более уязвимыми и имеют плохой прогноз [3]. Наиболее пострадавшей страной была Саудовская Аравия, на которую приходится более трех четвертей подтвержденных случаев в мире. До конца 2015 г. в Саудовской Аравии было зарегистрировано 1280 лабораторно подтвержденных случаев заболевания [10].Способ передачи полностью не изучен, но считается, что он передается при длительном тесном контакте с инфицированным человеком или верблюдом. Средний инкубационный период БВРС-КоВ составляет от пяти до шести дней и колеблется от двух до шестнадцати дней [3]. На сегодняшний день не существует эффективного лечения БВРС-КоВ, и пациенты получают поддерживающее лечение в зависимости от потребности пациента [11]. Были предприняты некоторые попытки разработать вакцину, но на сегодняшний день нет эффективной и одобренной вакцины от БВРС-КоВ [12].

Вирусы, как правило, могут проникать в головной и спинной мозг через гематогенное или ретроградное распространение нейронов. Гематогенное распространение происходит через виремию (присутствие и размножение данного вируса в кровотоке). С другой стороны, ретроградное распространение вируса происходит, когда данный вирус поражает нейронную ткань на периферии с последующим распространением в ЦНС с использованием транспортных механизмов внутри нейронов для получения доступа к пораженным уязвимым областям.Примеры последнего типа включают бешенство и энцефалит, вызванный вирусом простого герпеса [13]. Хотя исследования показали, что некоторые коронавирусы обладают нейротропными и нейроинвазивными свойствами у различных хозяев, включая людей, свиней и грызунов, MERS-CoV никогда не выделялся из нервных тканей или жидкостей пораженных людей [8]. Это может быть связано с устойчивостью коронавирусов к культивированию с помощью систем культивирования in vitro. Кроме того, обычные услуги по культивированию коронавирусов недоступны в большинстве клинических лабораторий, а процесс выделения требует использования трудоемких культур эмбриональных органов, что требует много времени [14].В некоторых сообщениях объясняется механизм, с помощью которого коронавирусы достигают нервной системы, в основном гематогенным путем, когда вирус может либо оставаться в спящем состоянии в течение периода, прежде чем он сможет заразить эндотелиальные клетки гематоэнцефалического барьера, либо инфицировать лейкоциты, которые станут резервуар для распространения на другие сайты [8]. Это никогда не было доказано исследованиями. Кроме того, гематоэнцефалический барьер обладает рядом защитных свойств, препятствующих проникновению вирусов в мозг.В недавнем сообщении Joob и Wiwanitkit они предположили, что размер MERS-CoV (150–320 нм) является препятствием для проникновения через поры размером 1 нм в гематоэнцефалический барьер [15]. С нашей точки зрения и путем обзора исследований нейровизуализации, мы не обнаружили какого-либо менингеального усиления в большинстве случаев, которые подтверждают эту теорию. Мы предлагаем другую теорию, а именно аутоиммунную теорию с несколькими вовлечениями нервных тканей и кровеносных сосудов через аутореактивные Т-клетки, распознающие как вирусные, так и миелиновые антигены как сходные молекулы.Этот иммунный ответ, участвующий в индукции или обострении невропатологий, встречается конкретно у генетически предрасположенных людей [16]. Эта теория преобладает при объяснении неврологических осложнений других вирусов, таких как пандемический грипп A h2N1 pdm09 [17]. Это имеет терапевтическое значение, которое включает возможное улучшение при раннем применении пульсовой стероидной терапии и внутривенного введения иммуноглобулина до того, как произойдет повреждение тканей. Ранее в литературе сообщалось о стероидах и иммуноглобулинах для лечения пациентов, инфицированных SARS-CoV, наряду с рибавирином.Не было доказано, что они эффективны или снижают заболеваемость или смертность от болезни. Фактически, четыре исследования сообщили о вреде из-за стероидной терапии в виде аваскулярного некроза и стероид-индуцированного психоза у пациентов, инфицированных SARS-CoV [18]. Стероиды также использовались эмпирически для лечения некоторых пациентов, инфицированных БВРС-КоВ, без доказанной пользы или наблюдаемого положительного эффекта [19]. Однако мы считаем, что использование стероидов в случаях инфицирования БВРС-КоВ, которые проявляются или развиваются неврологическими осложнениями, будет полезно для снижения смертности и помощи в лечении заболевания благодаря их известным преимуществам при лечении неврологических заболеваний.Отсутствие опубликованных в литературе по этой теме исследований аутопсии может способствовать тому, что объяснение неврологических осложнений коронавирусов остается неясным.

В наших случаях ни одна из упомянутых выше теорий не способствует развитию, поскольку у наших пациентов наблюдались последствия системных осложнений. Первый случай объяснен внутримозговым кровоизлиянием в результате тромбоцитопении, диссеминированного внутрисосудистого свертывания и дисфункции тромбоцитов. Второй случай — полинейропатия в критическом состоянии, осложняющая длительное пребывание в отделении интенсивной терапии.Он полностью выздоровел с помощью поддерживающих мер, иммуномодулирующего лечения и физиотерапии. Три случая, описанные в литературе ранее вместе с нашими случаями, обобщены в таблице 2.

6.Заключение

Инфекция БВРС-КоВ — серьезное заболевание, поражающее несколько органов и вызывающее легочные, почечные, гематологические и желудочно-кишечные осложнения. БВРС-КоВ вызвал тревожную тревогу в секторе здравоохранения из-за количества подтвержденных случаев и смертей, особенно из-за отсутствия лечения для борьбы с этой вирусной инфекцией. Органы здравоохранения выпустили различные инструкции по предотвращению передачи болезни. Исследования и исследования продолжаются, чтобы найти лекарство или, возможно, способы правильно вести этот случай и минимизировать заболеваемость и смертность от этого заболевания.Было предложено несколько механизмов, посредством которых этот вирус влияет на центральную нервную систему, но точный механизм до конца не изучен. Для дальнейшего понимания механизма необходимы вскрытие трупа.

Конкурирующие интересы

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Границы | Тенденции в стратегиях диагностики MERS-CoV, SARS-CoV и SARS-CoV-2 (COVID-19): патентный обзор

Введение

Коронавирусы (CoV) представляют собой оболочечные вирусы с положительной РНК, которые принадлежат к семейству Coronaviridae, филогенетически подразделяются на роды α, β, γ и δ (1).β-коронавирусы включают SARS-CoV, MERS-CoV и SARS-CoV-2 (2), причем эти вирусы идентифицированы как возбудители зоонозных инфекций (3). Первый из них, тяжелый острый респираторный синдром (SARS), возник в Южном Китае в 2003 г. (1). Ближневосточный респираторный синдром (БВРС-КоВ) появился в Саудовской Аравии почти через десять лет после вспышки SARS-CoV (1, 3). Последний из них, тяжелый острый респираторный синдром, вызванный коронавирусом 2 (SARS-CoV-2), стартовал в китайской провинции Гуандун в ноябре 2019 года (4).

Коммерчески доступные тесты на CoV в настоящее время делятся на две основные категории: (A) Молекулярные анализы для обнаружения вирусной РНК с использованием методов на основе ОТ-ПЦР или стратегий, связанных с гибридизацией нуклеиновых кислот, и (B) Серологические и иммунологические анализы, которые в значительной степени зависят от обнаружения антител. продуцируются людьми в результате воздействия вируса или в результате обнаружения антигенных белков у инфицированных лиц (5).

CoV могут вызывать заболевания печени, нейронов и желудочно-кишечного тракта (6) и различные симптомы, такие как заболевание нижних дыхательных путей, что может привести к прогрессирующей и потенциально летальной атипичной пневмонии с клиническими симптомами, включая лихорадку, недомогание, лимфопению, затрудненное дыхание и т. Д. в некоторых случаях также понос (6, 7).Есть много способов передачи вируса, включая личный контакт, передачу аэрозоля и передачу через прикосновение. «Скрытая» передача может происходить через бессимптомных инфицированных людей, передающих вирус (8).

Было показано, что быстрое и точное обнаружение CoV полезно для предотвращения распространения болезни, а также для принятия решений руководителями общественного здравоохранения (9). Первым шагом в выявлении возможного присутствия вируса является измерение температуры человека, а физикальное обследование может помочь выявить пациентов с более тяжелым состоянием (6).Кроме того, образцы, такие как слюна, мазки из носа, экстракты трахеи и носоглотки, легочная ткань, мокрота, фекалии и кровь, должны быть изолированы и использоваться для тестирования (10, 11). Выделение вируса и обнаружение вирусных нуклеиновых кислот являются основными способами идентификации патогена (11). Полимеразная цепная реакция с обратной транскриптазой в реальном времени (rRT-PCR) была основным методом диагностики CoV и характеризуется быстрым обнаружением, хорошей чувствительностью и специфичностью (9, 12). Хотя ПЦР является «золотым стандартом» для обнаружения вирусов, были разработаны и другие методы для обнаружения РНК CoVs, в том числе несколько молекулярных методов, не основанных на ПЦР, таких как изотермическая амплификация нуклеиновых кислот (изотермическая амплификация с использованием петли — LAMP) и амплификации на основе последовательностей нуклеиновых кислот (9).

Кроме того, обнаружение вирусов с использованием таких методов, как иммунофлуоресцентный анализ, прямой флуоресцентный анализ антител, белковый микрочип, полупроводниковые квантовые точки, быстрое обнаружение нуклеокапсидных белков на основе MAb и анализы микронейтрализации, которые можно использовать для быстрого исследования наличия вирусов, имеют также были предложены (6, 11). Иммуноанализы особенно полезны, поскольку в них можно использовать моноклональные антитела для обнаружения вирусных антигенов менее чем за 30 минут без необходимости в дорогостоящих инструментах (6).

могут ускорить точную диагностику, но они имеют разные уровни чувствительности и специфичности теста (8, 13). Чувствительность теста характеризуется его способностью обнаруживать истинно положительный результат, то есть правильно идентифицировать людей, у которых есть заболевание. С другой стороны, специфичность идентифицирует истинно отрицательные, правильно идентифицируя людей, у которых нет заболевания (14). Однако достижение заявленных тестами значений специфичности и чувствительности может зависеть от того, как применяются тесты и как обрабатываются образцы.Параметры, которые могут быть изменены, включают процесс взятия пробы, ее транспортировку и хранение, а также подготовку и тестирование пробы (15). Тесты должны быть быстрыми и надежными, чтобы определять места вспышек вирусов и позволять органам здравоохранения предлагать соответствующие меры (16).

Таким образом, этот обзор направлен на оценку патентов, касающихся тенденций в стратегиях диагностики лиц, инфицированных SARS-CoV, MERS-CoV и SARS-CoV-2. Предоставляя эти данные, мы стремимся внести свой вклад в усилия по борьбе с текущей пандемией.

Методы

В рамках настоящего обзора патентов в базах данных Европейского патентного ведомства (ЕПВ) и Всемирной организации интеллектуальной собственности (ВОИС) был проведен поиск названий и отрывков, содержащих дескрипторы «коронавирус и MERS», «коронавирус и COVID», «коронавирус и 2019- nCoV »и« коронавирус и атипичная пневмония ». Всего для предварительной оценки из баз данных было выявлено 402 патента, из которых 224 были исключены из-за дублирования. После тщательной проверки названий и аннотаций было исключено 120 патентов, которые не попали в фокус (диагностика заболевания) нашего обзора.Еще 18 были исключены из-за отсутствия полных текстов. После ознакомления с полным текстом патентов еще 13 патентов были исключены, так как не вошли в обзор. В результате этого процесса отбора 27 патентов были отобраны для нашего критического анализа в соответствии с целью исследования. На рисунке 1 показана стратегия систематического поиска и проверки, использованная в этом обзоре, основанная на заявлении PRISMA.

Рисунок 1 . Схема патентного поиска и проверки.

Патентный поиск и проверка

Этот обзор охватывал патенты, опубликованные между 2003 и 2020 годами, период, который охватывает возникновение эпидемий SARS-CoV в Азии, MERS-CoV в Саудовской Аравии и нынешнюю пандемию SARS-CoV-2. Наибольшее количество патентов на методы диагностики, нацеленные на эти патогены, было зарегистрировано в период с 2003 по 2011 год (19 патентов) (рис. 2A).

Рисунок 2 . Окончательный отбор патентов. (A) Дата публикации. (B) Страна публикации патента. CN, Китай; КР, Республика Корея; США, Соединенные Штаты Америки. Другие: Калифорния, Канада; DE, Германия; JP, Япония; NL, Нидерланды; SG, Сингапур; WO, Всемирная организация интеллектуальной собственности. (C) Заявитель на патент. (D) Международный патентный класс (IPC). Прочее: A61K, Препараты для медицинских, стоматологических или туалетных целей; C07H, сахара; их производные; нуклеозиды; нуклеотиды; C12N, Микроорганизмы или ферменты; их композиции; размножение, сохранение или поддержание микроорганизмов; мутации или генная инженерия; питательные среды; нуклеиновые кислоты.

Китай (CN) произвел наибольшее количество патентов, с девятью, за ним следует Республика Корея (KR) с шестью патентами и Соединенные Штаты (США) с четырьмя патентами (Рисунок 2B). Эти страны обычно хорошо представлены в области подачи заявок на патенты благодаря своим передовым технологическим и научным секторам и, в этой области, их сильным новаторским достижениям в производстве методов диагностики заболеваний. Кроме того, в этих странах базируется большое количество медицинских и биотехнологических компаний (в том числе стартапов), которые являются мировыми лидерами в области диагностики и молекулярной биологии (17, 18).

Патент может быть подан несколькими различными научными организациями, включая промышленные лаборатории, университеты и / или независимых исследователей. Как и ожидалось, сектор промышленных лабораторий подал наибольшее количество патентов (19 из 27 заявок на патенты) (рис. 2C). В промышленном секторе компании, подавшие заявки на патенты, включали Gen-Probe Incorporated, Biomerieux BV, Beijing Applied Biological Tech Co. Ltd., Adaltis Inc., Корейский научно-исследовательский институт бионауки и биотехнологии, Шанхайский институт биологических наук, Институт биотехнологии Могама и Самсунг Электроникс Ко.Ltd. Университеты подали восемь патентов, иногда в партнерстве с компаниями, а иногда и независимо. Из выявленных в обзоре патентов семь были зарегистрированы независимыми исследователями. Процесс сотрудничества между университетами и промышленностью в разработке инновационных продуктов для здоровья и в других областях — это глобальная тенденция, которая приносит пользу как университетам, так и промышленности и, в конечном итоге, обществу (19). Каждый зарегистрированный патент имеет Международную патентную классификацию (IPC), которая классифицирует изобретение на основе технологической области, к которой оно принадлежит.В настоящем обзоре код C12Q означает « Измерение или тестирование процессов с участием ферментов, нуклеиновых кислот или микроорганизмов; композиции или бумаги для испытаний, следовательно, способы приготовления таких композиций; контроль состояния в микробиологических или энзимологических процессах » был представлен в 15 патентах (рис. 2D), за ним следуют C07K (пептиды) и G01N (исследование или анализ материалов путем определения их химических или физических свойств) с четырьмя патентами на каждый.В патентах, указанных в обзоре, использовались два основных метода целевой амплификации и иммуноферментный анализ (ELISA).

Методы и методы, использованные в патентах

Методы усиления цели

Методы амплификации стремятся использовать различные методы для многократной амплификации определенных участков генетического материала, присутствующего в образце, до обнаруживаемых диагностических уровней. Различные методы улучшают как чувствительность, так и специфичность техники, будь то путем добавления олигонуклеотидов и ферментов или путем контроля конкретных условий реакции.Большинство методов автоматизированы и дают количественные и точные результаты за короткий период времени. Они также устраняют необходимость в специализированном обучении и снижают риск заражения и человеческой ошибки (20). Эти методы позволяют производить рентабельные, воспроизводимые тесты с высокой чувствительностью и специфичностью, которые обеспечивают надежную диагностику (21). Существует два основных метода амплификации: полимеразная цепная реакция (ПЦР) и технологии изотермической амплификации (IAT), каждая из которых включает ряд методов, описанных ниже.

Полимеразная цепная реакция (ПЦР)

ПЦР — это ферментативный метод, который разделяет две цепи ДНК для получения множества копий гена с использованием праймера для маркировки местоположения и ДНК-полимеразы для непрерывной сборки копии в каждом сегменте (9). ПЦР с обратной транскриптазой в реальном времени (рОТ-ПЦР) — это недавно разработанный метод обнаружения на основе ПЦР, используемый для обнаружения и количественного определения нескольких видов в образце (22). Вирусные антигены, вирусные РНК, ДНК и биомаркеры могут быть обнаружены с помощью рОТ-ПЦР крови / сыворотки и образцов тканей (23).рОТ-ПЦР — популярный метод, поскольку он имеет множество преимуществ, включая скорость, обеспечивающую простой и чувствительный количественный анализ (9, 24). Однако были ситуации, в которых рОТ-ПЦР давала ложноположительные результаты, что ограничивало ее клиническое использование для обнаружения (25). Другим признанным недостатком рОТ-ПЦР является ее относительно высокая стоимость, связанная с приобретением оборудования, обслуживанием и необходимыми реагентами по сравнению с другими методологиями (26). Примечательно, что нехватка реагентов, необходимых для рОТ-ПЦР во время вспышки SARS-CoV-2, была серьезным ограничением для использования этой методологии, особенно в развивающихся странах (27).

Амплифицированный продукт и плавление зонда во время rRT-PCR распознавались по непрерывной флуоресценции (25), и ее измеряли после каждого цикла, причем ее интенсивность отражала количество ДНК в образце в определенный момент времени (28). Было разработано несколько видов rRT-PCR, таких как мультиплексная rRT-PCR, которая дает результаты, основанные на размере ампликона патогена при гель-электрофорезе. Однако этот метод имеет некоторые недостатки по сравнению с традиционной ПЦР, такие как невозможность контролировать размер ампликона без открытия системы и его несовместимость с некоторыми другими платформами (29).Количественная rRT-PCR (RT-qPCR) использует ту же методологию, но метод более эффективен, чем мультиплексная rRT-PCR, а также позволяет избежать контаминации (30).

RT-PCR страдают некоторыми ограничениями, такими как сложная работа; длительное время выполнения работ, требующее в среднем более 2–3 часов для получения результатов; их неспособность функционировать с низкой вирусной нагрузкой или с образцами, которые были собраны не очень тщательно; вариация в частоте диагностики; и потребность в дорогостоящем оборудовании и обученных специалистах для его использования (31, 32).Экспериментальный метод приводит к эффективности метода. Например, в тестах RT-PCR количество термических циклов может отражаться на концентрации вирусной РНК за счет увеличения количества циклов, что приводит к более высокой неопределенности в точности теста из-за небольшой вирусной нагрузки (33). По этой причине сообщается о высоком уровне ложноотрицательных результатов заражения COVID-19 (34).

Патенты, идентифицированные в обзоре с использованием ПЦР

В таблице 1 представлена ​​сводка опубликованных патентов на тесты на коронавирус SARS и MERS.Mei et al. (39) в 2004 году запатентовали многоканальный комбинированный микрожидкостный чип, пригодный для обнаружения вируса SARS. В изобретении используется метод ПЦР для реализации интермодального обнаружения RT-PCR, чтобы обеспечить лучшую точность, чувствительность, стабильность, простоту работы и быстрое обнаружение. Тест занимает 25 минут и является недорогим, поскольку праймер не требует флуоресцентной метки. Как правило, для обнаружения патогенов используется вложенная двойная ПЦР; однако его работа считается утомительной, а точность составляет всего 40–60%.Однако вирус SARS может быть обнаружен в очень низких концентрациях, предел обнаружения достигает 10 ^-2 копий / 100 мкл. Тип используемого образца — слюна пациента. Микрожидкостный чип основан на трубопроводе, резервуаре, содержащем жидкость, и реакционном резервуаре, расположенном на трубопроводе подачи пробы между резервуаром, содержащим жидкость. Материалы, из которых состоит микрожидкостный чип ПЦР, такие как поликарбонатный (ПК) пластик, кварц и стекло, устойчивы к светопроницаемости. В состав чипа входит множество резервуаров для жидкости, микроканалов и реакционных трубок миллиметрового размера или реакционных лунок (бассейнов) (62, 63).

Таблица 1 . Опубликованы патенты на тесты на коронавирус SARS и MERS.

Artus Ges Fuer Molekular Biolog (40) в 2004 году описал количественный метод ПЦР в реальном времени для обнаружения SARS. В наборах используются олигонуклеотиды для обнаружения вируса SARS с использованием биологического образца, такого как биологическая жидкость (в частности, мокрота), фекалии или кровь. Авторы изобретения заявляют, что изобретение обеспечивает эффективный, чувствительный и надежный метод qRT-PCR для обнаружения вирусов и позволяет обнаруживать все известные варианты вируса и исключать всех других близкородственных Coronaviridae.Преимущество метода заключается в количественном обнаружении вируса, связанного с SARS, с теоретическим пределом текучести 10 генома, что соответствует 120 копий РНК на мл биологического образца. Таким образом, метод ОТ-ПЦР верен как минимум в 95% исследованных случаев.

Briese et al. (36) в 2004 году разработали анализ ПЦР и ОТ-ПЦР для обнаружения SARS-CoV. В изобретении используются биологические образцы, такие как биологические жидкости, включая спинномозговую жидкость, перикардиальную жидкость, перитонеальную жидкость, слюну, сыворотку, кал и мочу, и позволяет проводить быструю, чувствительную и специфическую молекулярную диагностику вируса.Кроме того, изобретение обеспечивает синтетическую последовательность нуклеиновой кислоты, содержащую 10-30 последовательных нуклеотидов, включая N-область SARS. Более того, синтезированные цепи ДНК могут впоследствии служить дополнительными матрицами для тех же последовательностей праймеров, и поэтому ПЦР может использоваться для обнаружения существования определенной последовательности в образце ДНК. Чувствительность метода показала, что 500 копий в ~ 100 нг общей РНК, извлеченной посмертно у жертвы SARS.

Wu и Gao (43) в 2004 году запатентовали целевую последовательность для идентификации вируса SARS-ассоциированного вируса с использованием технологии генной диагностики с использованием праймера RT-PCR, зонда с короткой ручкой и круглого кольца и набора.В изобретении кровь используется для быстрого, своевременного, специфического и чувствительного определения наличия вируса. Обнаружение может быть выполнено за 2 часа для 1–10 копий, что значительно повышает чувствительность обнаружения гибридизации. Более того, отбор целевой точки производился со стабильной точкой без мутировавшего участка длиной в диапазоне 120–180 п.н. Набор по изобретению включает экстракт РНК, раствор для ПЦР, положительный контроль и автономный реагент.

Изобретение Иноуэ и Хонга (44) в 2005 году предоставило простой, чувствительный и специфический диагностический тест по сравнению с тремя доступными коммерческими тестами.Для обнаружения SARS-CoV использовался одноэтапный метод ПЦР, а не два обычных. Этот тест основан на качественном анализе амплификации нуклеиновых кислот для обнаружения SARS-CoV в образцах пациентов, таких как плазма, мазок из горла, сыворотка, слюна, мокрота, и использует специальные пары праймеров, разработанные из неструктурного белка SARS-CoV. 1 (NSP1), предполагаемая протеиназа. В изобретении предлагается набор для обнаружения ОТ-ПЦР на основе геля, который включает один или несколько праймеров и / или зондов и может содержать нуклеиновую кислоту положительного контроля или, по крайней мере, ее часть, содержащую область NSP1, в виде либо РНК, либо ДНК.

Праймеры, используемые в изобретении, должны иметь длину от 16 до 20 нуклеотидов, и продукт амплификации может быть обнаружен путем определения длины продукта амплификации. Предпочтительная часть области NSP1 для амплификации составляет от 4 609 до 7 003 нуклеотидов. Три других теста (диагностика SARS Эйкена, Артуса и Roche) были использованы для сравнения эффективности изобретения, что обеспечило наиболее чувствительное обнаружение. Изобретение достаточно чувствительно, чтобы обнаруживать несколько молекул РНК в каждой реакции ОТ-ПЦР с получением результатов за часы.

Кострикис (45) в 2005 году описал мультиаллельный анализ qRT-PCR на основе молекулярных маяков для обнаружения и различения между SARS-ассоциированными и другими изолятами CoV в клинических образцах, таких как носоглоточный аспират, стул или цельная кровь. Метод включает в себя толерантные к несоответствиям молекулярные маяки, четыре набора праймеров ПЦР для четырех различных вирусных генов и четыре разных молекулярных маяка, стандарт экзогенной РНК, который добавляется к образцу, который может быть подвергнут обратной транскрипции и амплифицирован одним из наборов праймеров. и пятый молекулярный маяк, который помечен другим флуорофором, специфичным для стандарта экзогенной РНК.

Множественные последовательности-мишени по настоящему изобретению представляют собой гены S, E, M и N в SARS-CoV. Образцы, протестированные с использованием четырех генов, показали 100% специфичность. Таким образом, обнаружение четырех целевых аллелей в одной пробирке сводит к минимуму вероятность пропуска вируса в образце и увеличивает чувствительность и специфичность метода. Набор содержит реагенты для проведения реакций амплификации, включая ПЦР, а также для предварительной обработки образцов, включая реагент, необходимый для высвобождения и / или очистки CoV (45).

В 2005 г. Lim et al. (46) разработали метод ПЦР и набор для выявления SARS-CoV. Данное изобретение обеспечивает набор праймеров, специфичных для CoV, и мишенями являются гены ORF1ab, S, E, M, N вируса. Набор праймеров может специфически обнаруживать вирус без перекрестной реактивности с другими CoV и снижать вероятность обнаружения ложных или ложноположительных результатов. ПЦР можно проводить в различных материалах, таких как полипропиленовые пробирки, 96-луночный планшет или микросхема ПЦР на основе силикона.Однако при использовании в микросхеме микросхемы ПЦР на основе кремния ПЦР также может быть проведена с помощью термоциклирования, что сокращает время реакции до 30 мин.

Park et al. (50) в 2006 году запатентовали набор для обнаружения SARS с использованием олигонуклеотидов, включая праймер и / или зонд, который был более чувствительным и специфичным, чем обычные тесты. Изобретение может обнаруживать раннюю стадию инфекции с использованием ОТ-ПЦР и биологических образцов, таких как фекалии, для выделения и очистки вирусной РНК. В способе можно смешивать ферменты, содержащие ДНК-полимеразу и / или обратную транскриптазу, с реакционной смесью, содержащей олигонуклеотиды, и можно добавлять образец РНК к подготовленной смеси и реакционный раствор для амплификации, содержащий образец РНК, полученный с использованием процесса RT-PCR. .

В 2008 году Парк (51) описал метод с использованием нуклеокапсида или антигена спайкового белка для диагностики SARS-CoV. Изобретение включает раствор, содержащий АТФ-церамид-N_моноклональное антитело SARS, хромогенное вещество. Антитело включает моноклональное антитело, а хромофор содержит фермент или золото. В этом методе в качестве типа образца используется кровь, а в качестве мишени для обнаружения вируса — гены IgG или N и S. Пациенту может быть поставлен диагноз только в том случае, если два разных образца дали положительный результат или один и тот же образец дал положительный результат дважды.

В 2012 году Jeong et al. (54) сформулировали олигонуклеотид определенной последовательности и фармацевтическую композицию в качестве физиологически приемлемого носителя, который можно использовать для обнаружения SARS-CoV. В изобретении предложен способ лечения и диагностики с использованием олигонуклеотидного аптамера, который имеет особое сродство с нуклеокапсидом и имеет больший эффект, чем антитело, будучи меньшим по размеру. Кроме того, молекула нуклеотида нечувствительна к изменениям температуры и быстро регенерируется.Мишень, используемая в этом изобретении, может представлять собой белок N или IgG. Аптамеры, используемые в изобретении, включают лиганды одноцепочечной ДНК, поскольку они обладают высокой аффинностью и сложной структурой, которая связывается с целевым белком и может быть идентифицирована с использованием системной эволюции лигандов путем экспоненциального обогащения (SELEX). Метод SELEX разделяет высокоаффинные ДНК и РНК-лиганды на целевые молекулы, включая белки и небольшие органические молекулы. Фармацевтическая композиция может быть приготовлена ​​путем смешивания и использования веществ, таких как смазывающие вещества, разрыхлители, солюбилизаторы, диспергаторы, стабилизаторы, суспендирующие агенты, пигменты и другие.Однако его использование ограничено, поскольку образцы, проанализированные этим методом, должны обрабатываться в сертифицированных лабораториях, что приводит к задержке результатов (64).

В 2012 году Kaiyuan et al. (55) описали пробирочный метод множественной флуоресцентной ПЦР-детекции для пяти типов коронавируса человека, OC43, 229E, NL63, HKU1 и SARS, который можно использовать в качестве реагента обнаружения для научных исследований и клинических применений. Образец, используемый в этой методике, представляет собой мазок из носоглотки, и зонды могут гибридизоваться с последовательностью нуклеиновой кислоты, амплифицированной праймерами.

Изотермическое усиление мишени

В отличие от ПЦР, методы изотермической амплификации требуют только одной температуры, что устраняет необходимость в термоциклерах (65). Этот метод быстр, чувствителен, не требует сильных источников энергии и легко реализуется в местах обслуживания или в ситуациях с ограниченными ресурсами. Однако этот метод имеет некоторые недостатки, такие как проблема создания совместимых пар праймеров, возможность генерировать неспецифические амплифицированные продукты (20, 66).Технологии целевой изотермической амплификации включают амплификацию на основе последовательностей нуклеиновых кислот (NASBA), транскрипционно-опосредованную амплификацию (TMA), петлевую изотермическую амплификацию (LAMP), амплификацию с помощью рекомбиназ (RAA) и амплификацию рекомбиназной полимеразы (RPA), которые обсуждаются ниже (67).

Представленный в 1991 г. Комптоном, NASBA представляет собой метод, обычно используемый для селективной амплификации фрагментов РНК (68). Это чувствительная к транскрипции система, идеально подходящая для специфической репликации нуклеиновых кислот in vitro (69), в которой используются два специфических олигонуклеотидных праймера и три фермента обратной транскриптазы вируса миелобластоза птиц (AMV) (70).РНКаза Н, РНК-полимераза и Т7 вместе с праймерами амплифицируют РНК-мишени при 41 ° C (71), образуя в конце реакции конечный продукт, оцРНК, детектируемый такими методами, как электрохемилюминесценция, гель-электрофорез и др. сферическое ферментативное детектирование и ферментно-связанный гель-анализ (20).

Подобно NASBA, TMA также использует изотермическую амплификацию с использованием обратной транскриптазы для получения кДНК из целевой РНК. Затем РНК-полимераза генерирует комплементарную РНК, полученную из кДНК, таким образом амплифицируя исходную интересующую РНК-мишень.Он демонстрирует быструю кинетику, производя до 1000 копий целевой РНК за реакцию. Полученные ампликоны можно детектировать с помощью гель-электрофореза или олигонуклеотидных зондов (20, 72). Как и NASBA, ему необходимо тщательно контролировать температуру реакции, чтобы денатурировать вторичные структуры. Результаты коммерчески доступных анализов ТМА на вирус иммунодефицита человека (ВИЧ), вирус гепатита С (ВГС) и вирус гепатита В (ВГВ) аналогичны результатам для коммерческой ОТ-ПЦР (73).

За последние 10 лет LAMP стал часто используемым методом из-за его эффективности, чувствительности и специфичности для диагностики.Метод основан на использовании четырех специфических внешних и внутренних праймеров, ответственных за амплификацию нуклеиновой кислоты (65). Он обеспечивает быстрое обнаружение (около часа), простоту использования и только одну температуру для инкубации (74). Несколько тестов LAMP были применены для обнаружения различных патогенов, таких как паразиты, бактерии и вирусы, включая грипп, лихорадку Эбола, вирус Зика, желтую лихорадку, MERS-CoV и SARS-CoV-2 (75). Более того, это можно проводить с различными образцами, такими как кровь, моча, слюна и сперма (76).

В исследовании Wang et al. (77), анализ LAMP продемонстрировал 100% чувствительность и специфичность, при этом реакция завершилась за 60 минут, в то время как анализ RT-PCR потребовал 82 минуты. Полученные результаты были наглядными и легко наблюдаемыми. Этот метод оказался мощным инструментом для мониторинга подозреваемых пациентов и групп риска путем выявления SARS-CoV-2. Исследование Park et al. (78) использовали неочищенный образец непосредственно с методом LAMP, поскольку его высокая эффективность амплификации позволяла детектировать результаты с помощью колориметрических методов.Исследования уже продемонстрировали, что анализ RT-LAMP можно использовать для обнаружения MERS-CoV с использованием праймеров, направленных на последовательность вирусного N-белка.

RPA характеризуется минимальной потребностью в пробоподготовке, низкой рабочей температурой (37 ° C), использованием лиофилизированных реагентов, простотой, чувствительностью, селективностью и быстрой амплификацией (около 104 раз за 10 мин). В этом методе используются два праймера и один зонд, а для раскручивания ДНК и отжига праймеров используются ферменты рекомбиназы (79, 80).Он может использовать несколько образцов, таких как кровь, сыворотка, плазма, кал, моча. Кроме того, поскольку реагенты были высушены вымораживанием, набор RPA можно хранить при комнатной температуре в течение нескольких месяцев (81).

RAA использует два праймера, три специфических фермента и три белка для амплификации ДНК при 39 ° C примерно за 30 минут. Ферменты включают рекомбиназу UvsX, экстрагированную из E.coli , для отжига праймеров модельной ДНК, одноцепочечного ДНК-связывающего белка (SSB), для образования структуры D-петли для поддержания одноцепочечного состояния модельной ДНК с помощь ДНК-полимеразы для амплификации и удлинения (82).В этих методах можно использовать обратную транскриптазу с флуоресцентным зондом или без него для обнаружения в реальном времени ампликонов РНК (83, 84), имеет высокую специфичность и чувствительность, проста в использовании и может поставить клинический диагноз за считанные минуты ( 85).

Патенты с использованием изотермической амплификации мишени

В патентах, указанных в этом обзоре, Silleke и Biomerieux B.V. (41) использовали последовательности нуклеиновых кислот в качестве праймеров для обнаружения SARS-CoV с помощью NASBA. Выбранные для амплификации области-мишени соответствуют гену, который кодирует нуклеокапсидный белок SARS-CoV.В изобретении также рассматривается использование методологии и предлагаемых праймеров для количественного определения вируса до и после терапии путем сбора образцов из носоглоточной аспирации, кала или крови. При оценке аналитической чувствительности праймеров они показали 2,5 копии РНК in vitro при амплификации (41).

Изобретение 2005 года Mineka et al. (48) также используют метод обнаружения SARS-CoV с помощью RT-LAMP путем обнаружения генов ORF1ab, R2 и R3 за 20-35 минут при наличии 2.5–10 экз. Сначала был приготовлен олигонуклеотидный праймер, который селективно гибридизуется с нуклеотидной последовательностью, специфичной для SARS-CoV, а затем используется метод LAMP для идентификации вируса.

Патент 2010 г., выданный Kacian и Gen-Probe Inc. (53), описывает метод обнаружения SARS-CoV с помощью TMA. Тесты достигли чувствительности 100–1000 копий со 100% реактивностью с конечной точкой обнаружения 80 копий / мл. Тесты проводились с использованием мазка из носоглотки в качестве образца. При оценке специфичности и чувствительности зонд обнаружения не реагировал перекрестно с ВИЧ, HBV, парвовирусом и HCoV-229E (вирусной нуклеиновой кислотой из штамма коронавируса человека).

Патент 2018 г.Ан и др. (57) использовали праймеры, нацеленные на гены ORF1b и N в образцах мокроты и легочной ткани, для идентификации БВРС-КоВ. Метод имеет высокую специфичность и не требует контроля температуры, поэтому оборудование было относительно недорогим. Для проверки специфичности праймеров по отношению к БВРС-КоВ использовали шесть различных вирусов: грипп-A (h2), грипп-A (h4), грипп-B1, грипп-B2, метапневмовирус человека (MPV) и 229E. отправлено в RT-LAMP. Праймеры амплифицировали только образец, содержащий БВРС-КоВ, тем самым доказав его специфичность.Наконец, эффективность LAMP сравнивалась с эффективностью анализов ОТ-ПЦР, доступных на рынке, и было показано, что она имеет лучшую чувствительность и более короткое время реакции.

Патент 2018 Wang et al. (58) описывает набор для обнаружения SARS-CoV и MERS-CoV с использованием RPA. Специфичность зонда и праймера оценивалась, и перекрестных реакций с другими тестируемыми типами вирусов не наблюдалось. Минимальный предел обнаружения составил 10 копий в модели SARS-CoV и 100 копий в модели MERS-CoV.Показано, что срок службы тестов составляет 1 год, что является одним из основных преимуществ этого теста, помимо его низкой стоимости и предотвращения ложноотрицательных результатов.

Патент Чжоу и др. (59), опубликованный в 2018 году, описывает метод RAA с обратной транскрипцией (RT-RAA) для обнаружения MERS-CoV с использованием праймера и флуоресцентного зонда. Тесты занимают ~ 20 минут и используют мазок из носоглотки. Предел обнаружения составлял 10 копий / мл, а специфичность была доказана путем внесения в метод распространенных патогенов, таких как вирус гриппа A h2N1, грипп N, респираторно-синцитиальный вирус и риновирус.

Иммуноферментный анализ, связанный с ферментом (ELISA)

Наконец, количественные аналитические методы, которые выполняют реакции антиген-антитело посредством колориметрического изменения с помощью ферментного конъюгата и субстрата, полезны для количественных и качественных результатов в отношении молекул в биологических жидкостях. Одним из наиболее популярных из этих методов является твердофазный иммуноферментный анализ (ИФА), поскольку его можно использовать для количественного определения веществ при очень низких концентрациях (86).

Этот метод состоит из аналитического биохимического анализа с высокой чувствительностью и специфичностью для обнаружения и качественного или количественного анализа аналита без использования дорогих и сложных устройств.В качестве аналита можно использовать любое вещество, будь то конкретный белок или его смесь. Его методология включает производство моноклональных или поликлональных антител с использованием антигенов. Для обнаружения белков часто выбирают методы радиоиммуноанализа с использованием радиоизотопов или флуоресцентных маркеров. В последнем методе количественная оценка белка происходит косвенно, при этом поглощение цвета, создаваемое химической связью из-за присутствия красителя, пропорционально количеству белка.Эти методы демонстрируют хорошую чувствительность и пределы обнаружения, а также возможность количественной оценки ниже наномасштаба (87). Исследование, проведенное Xiang et al. (88) сообщили об использовании ELISA в тестах на антитела IgM и IgG, направленных на диагностику COVID-19, с получением высокой чувствительности и специфичности в отношении их обнаружения.

Тем не менее, в тестах, основанных на обнаружении антител, могут быть ложноотрицательные результаты. Антитела IgM вырабатываются как часть раннего иммунного ответа на начальной стадии инфекции, в то время как антитела IgG указывают на то, что болезнь вступила в период выздоровления или могут присутствовать, если ранее была инфекция (89, 90).Тесты на антитела используются в случаях, когда ОТ-ПЦР отрицательна и существует эпидемиологическая связь с инфекцией SARS-CoV-2, а также в период, когда симптомы впервые проявляются и вирусная нагрузка высока (91). Ложноотрицательные случаи в этом типе теста могут возникать в ситуациях, когда антитела находятся рядом с зародышевой линией, способной связываться с антигенами SARS-CoV-2 (92). Другой проблемой, которую представляет иммунологический анализ, является высокая частота ложноположительных случаев у серонегативных пациентов.Вероятно, это связано с несоответствующим временем сбора образцов в зависимости от стадии инфекции, а также с наивными антителами IgM, которые могут давать неверный результат из-за низкого действия антител. Однако поиск изотипов с переключением классов, в данном случае IgG, может помочь снизить риск ошибок. Кроме того, антиген-мишень также важен, когда тестируемый вирус способен мутировать, поскольку в его структуре будут присутствовать те же вирусные антигены (93).

Патенты с использованием ELISA

В 2004 г. Che et al.(37) разработали и запатентовали группу моноклональных антител, принадлежащих к IgG1 или IgG2b, со специфической способностью связываться с белком SARS-CoV N через гибридому, в дополнение к предоставлению реагента для делеции антигена SARS-CoV. В клиническом исследовании сэндвич-набор для ELISA с двойными антителами обнаружил антиген SARS-CoV в сыворотке крови пациентов, получив высокую специфичность и чувствительность. Не было перекрестной реактивности с культурами клеток, которые не были инфицированы SARS-CoV.

Houde and Lacroix (38) в 2004 году создали in vitro диагностический метод для обнаружения наличия или отсутствия антител, указывающих на SARS-CoV, путем связывания их с пептидом или его аналогом с образованием иммунного комплекса.В анализе ELISA пептид был адсорбирован или ковалентно связан в лунках микротитрационного планшета, обработанного сывороткой или исследуемой биологической жидкостью. После промывания антителами против человеческого IgG или против человеческого IgM, IgA метили пероксидазой и добавляли в лунки и для определения пероксидазы с соответствующим субстратом. Клинические образцы могут варьироваться от культивируемых клеток, клеточных супернатантов, клеточных лизатов, сыворотки, плазмы, биологической жидкости до образцов тканей.

В 2005 г. Qin et al. (49) разработали эпитоп белка нуклеокапсида SARS-CoV.Этот полипептид имеет высокое сродство к антивирусным антителам SARS, а антитело, разработанное в соответствии с изобретением, имеет высокое сродство к SARS-CoV. Сообщается, что метод обнаружения прост, чувствителен и отличается высокой точностью. Он использует IgG и IgM, а также образцы сыворотки или мокроты от пациентов для обнаружения вируса. Парк (51) сформулировал метод диагностики SARS-CoV с использованием антигена нуклеокапсидного белка (SARS-CoV-N) или белка-шипа (SARS-CoV-S). В этом методе используется человеческое антитело против IgG, конъюгированное с HRP, или моноклональное антитело SARS-CoV-N, смешанное с образцом, содержащим SARS-CoV, для адсорбции антитела SARS-CoV-N.Наконец, в 2019 году Jeong et al. (61) и Han et al. (60) разработали антиген для диагностики БВРС-КоВ с использованием слитого белка NC, который включал фрагмент N-концевого домена и фрагмент С-концевого домена белка N CoV. Они использовали IgG и сравнили свои инновации с уже доступным на рынке набором от Euroimmun ^® . Изобретение Han et al. показал положительные результаты для сыворотки человека, разведенной в 128 раз, тогда как коммерческий набор показал положительные результаты только для сыворотки, разведенной в 16 раз.В этом патенте использовали блокирующий ИФА, а также в качестве образцов крови, биологической жидкости, слюны и мокроты. Хотя оба патента показали высокую специфичность, последний показал более высокую чувствительность (60).

Диагностические тесты на COVID-19

Аналогичный поиск в Google Patents был выполнен с использованием ключевых слов «SARS-CoV-2 и diag ^* » с IPC C12Q для патентов, опубликованных с января 2020 года для тестов на выявление нового коронавируса. Это позволяет выделить текущие тенденции в этой области, а также сравнить сходства и различия в запатентованных тестах на SARS-CoV-1 и MERS-CoV с тестами, относящимися к SARS-COV-2.В таблице 2 показаны основные обнаруженные патенты и характеристики каждого изобретения.

Таблица 2 . Опубликованные патенты на тесты SARS-CoV-2 (COVID-19).

В некоторых идентифицированных патентах также использовались методы ПЦР, аналогично предыдущим патентам. В одном из изобретений Xu et al. (94) опубликовали набор для быстрого обнаружения SARS-CoV-2, разработанный с использованием метода флуоресцентной ОТ-ПЦР и зонда гидролиза. Набор состоит из зонда, праймеров и положительного и отрицательного контроля для обнаружения.Три фрагмента обратной транскрипции сегментов вируса и комплементарной ДНК человека использовали в качестве положительного и отрицательного контроля соответственно. Среди преимуществ набора, описанного изобретателями, — простота использования, экономия реагентов и снижение перекрестного загрязнения. Время обнаружения составляло около 2 часов, что свидетельствует о хорошей специфичности при использовании трех областей вируса для амплификации и обнаружения. В наборе [A] можно использовать образцы, полученные с помощью мазка из глотки, экстракта носоглотки и мокроты.

Gu et al. (95) описали изобретение пары праймеров для обнаружения вирусной РНК нового коронавируса с помощью количественной флуоресцентной ПЦР. Ген нуклеокапсида является мишенью для амплификации в этом изобретении, поскольку он обеспечивает высокую степень детектирования из-за его низкой молекулярной массы и генерации большого числа амплифицированных копий. Кроме того, разработанный праймер устойчив к мутации вируса, что позволяет избежать снижения чувствительности и образования ложноотрицательных результатов. Метод позволяет использовать несколько образцов, таких как мазок из глотки, альвеолярный лаваж, слюна, кровь, моча и кал.

Используя ту же методологию ПЦР с множественной флуоресценцией, Yan et al. (96) разработали другой набор для одновременного обнаружения нескольких генов SARS-CoV-2. Он имеет 70-минутный процесс обнаружения и может использоваться с мазками из глотки, мокротой и жидкостями альвеолярного лаважа. Тест показал минимальный предел обнаружения 2 пг / мл. Другой патент Wang et al. (97) использовали цифровой микрокапельный набор для ПЦР для обнаружения SARS-CoV-2 путем амплификации генов ORF1ab и N. Преимущества этого теста описаны как получение результатов с более прямой интерпретацией и более высокая чувствительность обнаружения, чем количественная ПЦР, а также высокая стабильность, повторяемость, низкая способность обнаружения вирусной нагрузки и уменьшение количества ложноотрицательных результатов.

Другие патенты, связанные с COVID-19, используют методы изотермической амплификации, наборы и компоненты для обнаружения SARS-CoV-2 также были запатентованы. Сон Мин-Сок и Пэк Юн-хи (98) разработали набор праймеров, позволяющий детектировать вирус любым методом изотермической амплификации в течение 90 минут от гена нуклеокапсида. В том же духе другое изобретение Wan et al. (99) представили набор для быстрого обнаружения с использованием метода LAMP, имеющий в качестве целевых генов ORF1ab и N. В этом изобретении реагент для обнаружения был получен путем сублимационной сушки, что позволяет его транспортировать при комнатной температуре, а не в жестких условиях хранения при — 20 ° C, при которой часто необходимо хранить эти реагенты.Время обнаружения набора составляет около 1-2 часов, и его можно прочитать невооруженным глазом. Метод LAMP также был использован в другом изобретении Cui et al. (100) с использованием гена-мишени ORF1ab. Применяемая методика позволяет идентифицировать наличие вируса по изменению цвета образца. После 30 мин обнаружения ярко-зеленый цвет указывает на положительный результат, а желтый / оранжевый — на отрицательный.

Альтернативные методики испытаний

Иммуноферментный магнитный хемилюминесцентный анализ на основе пептидов (101, 102) — еще один метод с хорошей чувствительностью, который не был обнаружен при поиске патентов.Его также можно использовать в сочетании с рОТ-ПЦР, имея положительную частоту для IgG и IgM 71,4 и 57,2% соответственно. Следовательно, сочетание этого иммуноанализа с ОТ-ПЦР в реальном времени может повысить точность диагностики COVID-19 (103–106).

Что касается метода ELISA, то он обычно широко используется из-за его практичности, низкой стоимости и простоты выполнения, в идеале, когда каждая страна разрабатывает свои собственные технологии, очищая свои местные антигены для достижения хороших результатов тестирования (107–109).

Другими методологиями, не включенными в наш обзор, но с многообещающими характеристиками, являются методологии на основе CRISPR (110–113), иммуноанализ латерального потока (5), вязкоупругие испытания (114) и биосенсоры на COVID-19 (115), задуманные как альтернативы обычным методам.В выявленных патентах изотермическая амплификация оказалась более быстрым, простым и более чувствительным методом обнаружения SARS-CoV-2 (116–119).

Возможные ограничения патентованных тестов

Мы знаем, что тестирование на антитела необходимо, но результаты реагента на IgG не могут гарантировать новые положительные результаты для рОТ-ПЦР, и необходимы дальнейшие исследования, чтобы продемонстрировать защиту от COVID-19 у пациентов с реагирующим IgG (109, 120). Существует огромное количество тестов, но они используются с критериями, основанными на литературе, потому что только массовое тестирование может гарантировать критерии открытия и закрытия городов (47, 121–125).Специфичность и чувствительность тестов, описанных в этом обзоре, могут измениться из-за факторов окружающей среды. Согласно Younes et al. (126), в анализах ELISA могут быть ложноположительные результаты, поскольку белок N является наиболее консервативным вирусным белком среди бета-коронавирусов человека. Таким образом, антигены, используемые в наборах, могут давать неточные результаты. Среди других возможных причин неточных результатов — перекрестное связывание с другими коронавирусами (MERS-CoV, SARS-CoV-1) или потому, что используемые антигены обладают способностью реагировать с вирусами, вызывающими простуду (HKU1, 229E, OC43, NL63) зимой, когда они циркулируют в больших количествах (126).Чтобы обойти эту проблему, методы диагностики были улучшены с использованием белка spike, который обнаруживает два домена белка S (S1 и S2) (127).

В исследовании Yang et al. (128), LAMP продемонстрировал аналогичную чувствительность к ПЦР и специфичность 99% в 208 протестированных клинических образцах. Это было связано с использованием от шести до восьми инициаторов для идентификации различных регионов. Несмотря на то, что ПЦР считается золотым стандартом, она чувствительна к факторам окружающей среды, которые могут вызывать изменения обсуждаемых параметров.Проблемы, связанные с вирусной нагрузкой и медленным или отсутствующим ответом антител, могут повлиять на результаты. Его рекомендуется применять с третьего дня появления симптомов при высокой вирусной нагрузке (129, 130). Интересно, что также наблюдается заметная нехватка технологических продуктов из развивающихся стран и даже из стран Европы, которые обычно играют важную роль в разработке диагностических продуктов. Таким образом, существует потребность в больших инвестициях в разработку практичных, быстрых и надежных технологий, которые можно использовать для проведения массовых испытаний, необходимых для победы в этой битве с COVID-19.Более того, текущие публичные патентные знания могут быть ограничителем в разработке нового фармацевтического продукта или процессов, и в конкретное время, например, во время вспышки COVID-19, поэтому эти препятствия должны быть на месте. Таким образом, эти пробелы в знаниях только создают новые сомнения, которые закладывают фундамент (131).

Сильные стороны и ограничения

Среди сильных сторон этого исследования — акцент на патенты в обзоре, который дает обзор ситуации и тенденций роста в конкретной области знаний или интересующем продукте.Кроме того, патенты часто содержат технологическую информацию, которая не может быть найдена полностью в статьях, поскольку компании тщательно защищают свои изобретения, и это может обеспечить лучшее общее понимание тестов. Что касается ограничений этого обзора, некоторые инновационные методы диагностики не запатентованы немедленно, и авторы предпочитают публиковать свои данные быстро с помощью научных статей. Таким образом, большинство патентов, обнаруженных для диагностики COVID-19, основаны на известных методах, таких как ПЦР, изотермическая амплификация и ELISA.Потенциальная предвзятость в патенте идентификации и включения может произойти из-за 18-месячного периода конфиденциальности, который патентные ведомства предоставляют изобретателям. Однако поиск проводился в соответствующих патентных базах данных с использованием комплексных поисковых терминов и тщательного процесса отбора, чтобы избежать этого риска.

Заключение

Известно, что постановка быстрого и надежного диагноза заболевания имеет первостепенное значение для принятия фундаментальных мер по контролю и лечению болезни.Это особенно верно в случае вирусов, особенно CoV, которые поражают людей множеством различных способов и могут потребовать быстрой и специальной помощи в случае заражения. Мы описываем патенты, содержащие диагностические методы, ориентированные на CoV, необходимые для обнаружения SARS-CoV, MERS-CoV и SARS-CoV-2. Мы также представили в этом обзоре некоторые данные из исследований испытаний, уже проведенных исследователями, а также из патентов, направленных на другие инфекции, вызванные CoV. Молекулярные методы, такие как RT-PCR, ELISA и технологии изотермической амплификации, положительно влияют на простые, быстрые, чувствительные, специфические и недорогие тесты.Знания, полученные с другими типами CoV, могут способствовать борьбе с COVID-19 и текущей пандемией.

Необработанные данные, подтверждающие выводы этой статьи, будут предоставлены авторами без излишних оговорок.

Авторские взносы

JN, AS и AO проанализировали и интерпретировали данные и выполнили черновик. AG, LQ-J и LB сделали критический обзор интеллектуального контента. М.С. реализовал концепцию и дизайн рукописи.HC и NM внесли свой вклад в окончательный вариант рукописи и предоставили ресурсы для исследования. Все авторы внесли свой вклад в статью и одобрили представленную версию.

Финансирование

Это исследование частично финансировалось Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior — Brasil (CAPES) — Финансовый кодекс 001.

Конфликт интересов

Авторы заявляют, что исследование проводилось при отсутствии каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могут быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.

Благодарности

Авторы благодарят компании CAPES, FAPITEC / SE и CNPq (Бразилия) за финансовую поддержку. Мы посвящаем эту статью всем работникам здравоохранения, которые умирают или сталкиваются с COVID-19. NM выражает признательность Португальскому фонду науки и технологий в рамках программы Horizon 2020 (PTDC / PSI-GER / 28076/2017).

Список литературы

1. Alsaadi EA, Jones IM. Мембранные связывающие белки коронавирусов. Future Virol. (2019) 14: 275–86. DOI: 10.2217 / fvl-2018-0144

CrossRef Полный текст | Google Scholar

4. Ди Дженнаро Ф., Пиццол Д., Маротта С., Антунес М., Ракальбуто В., Веронезе Н. и др. Коронавирусные заболевания (COVID-19): текущее состояние и перспективы на будущее: обзорный обзор. Int J Environ Res Public Health. (2020) 17: 2690. DOI: 10.3390 / ijerph27082690

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

5. Картер Л.Дж., Гарнер Л.В., Смут Д.В., Ли Й., Чжоу К., Савесон С.Дж. и др.Методы анализа и разработка тестов для диагностики COVID-19. САУ Cent Sci. (2020) 6: 591–605. DOI: 10.1021 / acscentsci.0c00501

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

6. Мунгру М.Р., Хан Н.А., Сиддиги Р. Новый коронавирус: современное понимание клинических особенностей, диагностики, патогенеза и вариантов лечения. Патогены. (2020) 9: 297. DOI: 10.3390 / pathogens

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

7.Adhikari SP, Meng S, Wu YJ, Mao YP, Ye RX, Wang QZ и др. Эпидемиология, причины, клинические проявления и диагностика, профилактика и борьба с коронавирусной болезнью (COVID-19) в период ранней вспышки: обзорный обзор. Заражение бедностью. (2020) 9:29. DOI: 10.1186 / s40249-020-00646-x

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

8. Ян И, Пэн Ф, Ван Р., Гуань К., Цзян Т., Сюй Г. и др. Смертельные коронавирусы: пандемия атипичной пневмонии 2003 года и эпидемия нового коронавируса 2020 года в Китае. J Аутоиммунный. (2020) 109: 102434. DOI: 10.1016 / j.jaut.2020.102434

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

9. Шен М., Чжоу Й., Йе Дж., Аль-Маскри ААА, Кан Й., Зенг С. и др. Последние достижения и перспективы обнаружения нуклеиновых кислот для коронавируса. J Pharm Anal. (2020) 10: 97–101. DOI: 10.1016 / j.jpha.2020.02.010

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

11. Yu F, Du L, Ojcius DM, Pan C, Jiang S.Меры по диагностике и лечению инфекций, вызванных новым коронавирусом, вызвавшим вспышку пневмонии, возникшую в Ухане, Китай. Microbes Infect. (2020) 22: 74–9. DOI: 10.1016 / j.micinf.2020.01.003

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

12. Чжан Дж., Лю П., Ван М., Чен Дж., Юань В., Ли М. и др. Клинические данные 19 тяжелобольных пациентов с коронавирусной болезнью 2019: одноцентровое ретроспективное наблюдательное исследование. Z Gesundh Wiss. (2020) 21: 1–4. DOI: 10.21203 / RS.3.RS-20800 / v1

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

14. Trevethan R. Чувствительность, специфичность и прогностическая ценность: основы, гибкость и подводные камни в исследованиях и практике. Фронт общественного здравоохранения. (2017) 5: 307. DOI: 10.3389 / fpubh.2017.00307

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

15. Ли Нью-Йорк. Типы и частота преаналитических ошибок в клинической лаборатории университетской больницы Кореи. Clin Lab. (2019) 65: 1–11. DOI: 10.7754 / Clin.Lab.2019.1

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

16. Мадор Д.В., Мид Б.Д., Рубин Ф., Дил С., Линн Ф. Использование серологических анализов для подтверждения эффективности вакцин в доклинических и клинических испытаниях: встреча на перепутье. Вакцина. (2010) 2: 4539–47. DOI: 10.1016 / j.vaccine.2010.04.094

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

17. Фрю С., Саммут С., Шор А., Рамджист Дж. К., Аль-Бадер С., Резай Р. и др.Китайские биотехнологии здоровья и рынок миллиарда пациентов. Nat Biotechnol. (2008) 26: 37–53. DOI: 10.1038 / nbt0108-37

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

18. Киселев Д., Мацвай А., Абрамов И., Дедков В., Шипулин Г., Хафизов К. Современные тенденции диагностики вирусных инфекций неясной этиологии. вирусов. (2020) 12: 211. DOI: 10.3390 / v12020211

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

19.Roesler C, Broekel T. Роль университетов в сети субсидируемого сотрудничества в области НИОКР: пример биотехнологической промышленности в Германии. Ред. Рег. (2017) 37: 135–60. DOI: 10.1007 / s10037-017-0118-7

CrossRef Полный текст | Google Scholar

21. Бинсаид А.А., Аль-Хедхайри А.А., Мандил А.М., Шейх С.А., Куреши Р., Аль-Хаттаф А.С. и др. Валидационное исследование, сравнивающее чувствительность и специфичность нового набора для ОТ-ПЦР Dr. KSU h2N1 с ОТ-ПЦР в реальном времени для диагностики гриппа A (h2N1). Ann Saudi Med. (2011) 31: 351–5. DOI: 10.4103 / 0256-4947.83212

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

22. Кан ТС. Основные принципы разработки методов ПЦР в реальном времени, используемых в анализе пищевых продуктов: обзор. Trends Food Sci Technol. (2019) 91: 574–87. DOI: 10.1016 / j.tifs.2019.07.037

CrossRef Полный текст | Google Scholar

23. Nunes BTD, de Mendonça MHR, Simith DdeB, Moraes AF, Cardoso CC, Prazeres ITE, et al.Разработка ОТ-КПЦР и полувложенных ОТ-ПЦР для молекулярной диагностики хантавирусного легочного синдрома. PLoS Negl Trop Dis. (2019) 13: e0007884. DOI: 10.1371 / journal.pntd.0007884

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

24. Но Дж.Й., Юн С.В., Ким Диджей, Ли М.С., Ким Дж.Х., На В и др. Одновременное обнаружение тяжелого острого респираторного синдрома, ближневосточного респираторного синдрома и родственных коронавирусов летучих мышей с помощью ПЦР с обратной транскрипцией в реальном времени. Arch Virol. (2017) 162: 1617–23. DOI: 10.1007 / s00705-017-3281-9

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

26. Лай Ю.Л., Чунг Ю.К., Тан Х.С., Яп Х.Ф., Яп Г., Оои Э.Е. и др. Экономичная ПЦР с обратной транскриптазой в реальном времени (ОТ-ПЦР) для скрининга вируса денге с последующей быстрой мультиплексной ОТ-ПЦР в одной пробирке для серотипирования вируса. J Clin Microbiol. (2007) 45: 935–41. DOI: 10.1128 / JCM.01258-06

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

28.Кралик П., Риччи М. Базовое руководство по ПЦР в реальном времени в микробной диагностике: определения, параметры и все остальное. Передний микробиол . (2017) 8: 108. DOI: 10.3389 / fmicb.2017.00108

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

30. Ван З., Чжан И, Хе З, Лю Дж., Лан К., Ху И и др. Мультиплексный анализ RT-qPCR на основе кривой плавления для одновременного обнаружения четырех коронавирусов человека. Int J Mol Sci. (2016) 17: 1880. DOI: 10.3390 / ijms17111880

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

31.Li Z, Yi Y, Luo X, Xiong N, Liu Y, Li S и др. Разработка и клиническое применение экспресс-теста комбинированных антител IgM-IgG для диагностики инфекции SARS-CoV-2. J Med Virol. (2020) 92: 1518–24. DOI: 10.1002 / jmv.25727

CrossRef Полный текст | Google Scholar

32. Аббаси-Ошаги Э., Мирзаи Ф., Фарахани Ф., Ходадади И., Тайебиния Х. Диагностика и лечение коронавирусных заболеваний 2019 (COVID-19): результаты лабораторных исследований, ПЦР и компьютерной томографии грудной клетки. Int J Surg. (2020) 79: 143–53. DOI: 10.1016 / j.ijsu.2020.05.018

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

34. Лю Р., Лю Х, Юань Л., Хань Х., Шерин М.А., Чжэнь Дж. И др. Анализ дополнительного серологического обнаружения к тесту на нуклеиновую кислоту для диагностики инфекции тяжелого острого респираторного синдрома, вызванной коронавирусом 2 (SARS-CoV-2). Int Immunopharmacol. (2020) 86: 106746. DOI: 10.1016 / j.intimp.2020.106746

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

35.Wang J. Reagent Kit for LgG Immunoblotting Diagnosis of SARS Coronavirus Antibody. Патент Китая № 1,453,590. Хубэй, Китай: Гуанчжоу Ванфу Биотехнология (2003).

Google Scholar

36. Бризе Т., Липкин В., Паласиос Дж., Джабадо О. Методы и наборы для обнаружения коронавируса, связанного с атипичной пневмонией. Патент США № 20 040 265 796. Нью-Йорк, Нью-Йорк: Попечители Колумбийского университета (2004).

Google Scholar

37. Che X, Qiu L, Wen K. Моноклональные антитела к белку нуклеокапсида коронавируса SARS, гибридома для получения того же самого, агент для обнаружения, содержащий то же самое, и его использование.Патент Китая № 1,557,838. Guǎngzhōu, CN: Первый военный госпиталь Чжуцзян (2004 г.).

Google Scholar

38. Houde M, Lacroix J-M. Пептиды и их смеси для использования при обнаружении тяжелого острого респираторного синдрома, связанного с коронавирусом (SARS). Патент Канады № 2524609. Монреаль, Калифорния: Adaltis Inc. (2004).

Google Scholar

39. Мэй X, Чжоу X, Лю Д. Коробка с диагностическим реагентом для обнаружения коронавируса SARS с использованием метода транскрипционной ПЦР. Патент Китая №1,514,010. Далянь, Китай: Zhenao Group Co., Ltd. (2004).

Google Scholar

40. Artus Ges Fuer Molekular Biolog. Набор для диагностического обнаружения вируса, связанного с тяжелым острым респираторным синдромом, включает праймеры и зонды для полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией в реальном времени. Патент Германии № 000,020,315,159. Германия, Германия: Artus Ges Fuer Molekular Biolog. (2004).

Google Scholar

41. Sillekens PTG, Biomerieux BV. Последовательности нуклеиновых кислот, которые можно использовать в качестве праймеров и зондов при амплификации и обнаружении коронавируса SARS.Патент Всемирной организации № 2 004 111 274. Нидерланды, Нидерланды: Biomerieux BV. (2004).

Google Scholar

42. Виджайсри С., Гетман Д.К., Нельсон Н.С. и др. Составы и методы определения наличия коронавируса SARS в образце. Патент Канады № 2520146. Сан-Диего, Калифорния: Gen-Probe Inc. (2004).

Google Scholar

43. Ву Б., Гао Дж. Праймер для ОТ-ПЦР последовательности-мишени, зонд с короткой ручкой, набор реагентов и метод обнаружения коронавирусов, связанных с SARS, и их применение.Патент Китая № 1,548,550. Пекин, Китай: У Бинцюань. (2004).

Google Scholar

44. Иноуэ М., Хонг В. Чувствительный и специфический тест для обнаружения коронавируса SARS. Патент Всемирной организации № 2,005,059,177. Сингапур, SG: Агентство науки, технологий и исследований (2005).

PubMed Аннотация | Google Scholar

45. Кострикис Л.Г. Мультиаллельное молекулярное обнаружение коронавируса, связанного с SARS. Патент Всемирной организации № 2 005 021 798. Делавэр, США: Birch Biomedical Research LLC.(2005).

PubMed Аннотация | Google Scholar

46. Лим Х. К., Ким Ш., Хван Дж. Дж., Ли Ю. С., Ким Я. Сеул, КР. Праймер для обнаружения коронавируса SARS без перекрестной реакции с другими коронавирусами за короткое время, достаточное для полного обнаружения в полевых условиях, метод и набор для обнаружения коронавируса SARS с использованием того же . Патент Республики Корея № 1,020,050,058,620. Самсунг Электроникс Ко., Лтд. (2005 г.).

Google Scholar

47. Ма Дж., Джи М.Антитело, направленное на антиген белка коронавируса N SARS, и его использование для обнаружения коронавируса SARS или его антигена. Патент Китая № 15. Пекин, Китай: Ма Цзе. (2005).

Google Scholar

48. Минекава Х., Ватанабэ К., Кодзия С. Метод обнаружения коронавируса SARS. Патент Всемирной организации № 2,005,001,097. Токио, Япония: Эйкен Кагаку Кабусики Кайша (2005).

Google Scholar

49. Qin L, Li Y, Shi T. Антигенный детерминант белка нуклеокапсида коронавируса SARS и его применение.Патент Китая № 1566143. Шанхай, Китай: Шанхайский институт биологических наук (2005).

Google Scholar

50. Пак Х. Дж., Ха И-Дж., Ким М. Х. Праймер и зонд для обнаружения коронавируса SARS, набор, состоящий из праймера и / или зонда, и метод их обнаружения. Патент Всемирной организации № 2 006 022 459. Сеул, КР: Институт биотехнологии Могама (2006).

Google Scholar

51. Park JH. Безопасные и точные методы диагностики SARS с использованием нуклеокапсида или белка-шипа мутантного коронавируса SARS-Cov в качестве антигена.Патент Республики Корея № 1 020 080 012 449. Сеул, КР: Сеульский национальный университет; Промышленный фонд (2008 г.).

Google Scholar

52. Лу Дж., Прайс Дж. А. Младший, Юрсис Д. А., Вулф Д. М., Келлер Л. М., Хеллиер Т. Дж. И др. Анализ на коронавирус SARS путем амплификации и обнаружения последовательности репликазы. Патент США № 2 009 258 340. Нью-Джерси, Нью-Джерси: Becton Dickinson Co. (2009).

Google Scholar

53. Качян DL. Методы определения наличия коронавируса SARS в образце.Патент США №2010279276. Сан-Диего, США: Gen-Probe Inc. (2010).

Google Scholar

54. Jeong YJ, Je CS, Min WH. Аптамер, специфичный для тяжелого острого респираторного синдрома (SARS) — нуклеокапсид коронавируса и фармацевтическая композиция, содержащая его. Патент Республики Корея №20,120,139,512. Сонбук-гу, КР: Университет Кукмин; Фонд индустриально-академического сотрудничества (2012 г.).

Google Scholar

55. Кайюань К., Ли М., Сюй Л., Ву Дж, Чжан Д., Сюй С. и др.Метод обнаружения коронавируса человека OC43, 229E, NL63, HKU1 и SARS с помощью мультиплексной флуоресцентной полимеразной цепной реакции (ПЦР) в одной пробирке, а также праймеры, зонды и набор, принятые для данного метода. Патент Китая № 102 732 638. Гуанчжоу, Китай: Университет Сунь Ятсена (2012).

Google Scholar

56. Яна А., Мацунага Т., Ямаока Ю., Курояма Х. Йокогама, Япония. Антитело против коронавируса MERS, метод обнаружения коронавируса MERS с использованием антитела и набор, содержащий антитело .Патент Японии №2017145246. Yokohama City Univ; Kanto Chem Co. Inc. (2017).

Google Scholar

57. Ан Дж. Я., Сон М. С., Бэк Ю. Х. Набор праймеров для обнаружения БВРС-коронавируса и его использования. Патент Республики Корея № 1,020,180,125,141. Чхонджу, КР: Национальный университет Чунгбук; Фонд индустриально-академического сотрудничества (2018).

Google Scholar

58. Ван Л., Ван И, Чжан З. Набор зондов для праймера, комплект и метод обнаружения для выявления SARS-CoV (коронавирус тяжелого острого респираторного синдрома) и MERS-CoV (коронавирус ближневосточного респираторного синдрома).Патент Китая № 08,060,266. Пекин, Китай: Beijing Applied Biological Tech Co. Ltd. (2018).

Google Scholar

59. Чжоу Д., Ло Дж, Инь Q, Сюэцзюнь Ю. Флуоресцентный праймер RT-RAA (обратная транскрипционная рекомбиназа, способствующий амплификации) для обнаружения MERS-CoV (коронавирус ближневосточного респираторного синдрома), зонд и метод обнаружения. Патент Китая № 107,557,496. Нинбо, Китай: Международный туристический центр здравоохранения Нинбо (2018).

Google Scholar

60.Хан С.Л., Сон С.К., Джу ИЛ, Хе К.К., Дэ ГДж, Джиён Н. и др. Метод обнаружения коронавируса MERS с использованием слитого белка нуклеокапсида коронавируса MERS. Патент Республики Корея №102019008. Сеул, КР: Корейский центр по контролю и профилактике заболеваний, Korea Res Inst Bioscience & Biotechnology (2019).

Google Scholar

61. Чжон Д.Г., Юн С.В., Ким Г.К., Сон Д., Но Дж., Ан MJ. Сеул, КР. NC Fusion Protein, содержащий фрагмент N-концевого домена и фрагмент C-концевого домена нуклеокапсидного белка коронавируса MERS, и набор для диагностики коронавирусной инфекции MERS с использованием того же .Патент Всемирной организации № 2,019,066,389. Корейский научно-исследовательский институт биологии и биотехнологии (2019).

Google Scholar

62. Li Z, Li Y, Sekine S, Xi H, Amano A, Zhang D, et al. Разработка и изготовление портативного микрожидкостного чипа для непрерывной проточной ПЦР для репликации ДНК. Biomed Microdev. (2019) 22: 5. DOI: 10.1007 / s10544-019-0457-y

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

63. Бареа Дж. С., Ли Дж., Кан Д. К.. Последние достижения в области микрожидкостных технологий на основе капель для биохимии и молекулярной биологии. Микромашины. (2019) 10: 412. DOI: 10.3390 / mi10060412

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

64. Бачелет В.К. Знаем ли мы диагностические свойства тестов, используемых при COVID-19? Быстрый обзор недавно опубликованной литературы. Medwave. (2020) 20: e7890. DOI: 10.5867 / medwave.2020.03.7891

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

65. Ли Х, Ли К, Би З, Гу Дж, Сонг Д., Лей Д. и др. Разработка метода изотермической амплификации, опосредованной обратной транскрипцией (RT-LAMP), для обнаружения пегивируса свиней. J Virol Methods. (2019) 270: 59–65. DOI: 10.1016 / j.jviromet.2019.04.019

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

66. Лу Х, Ши Х, Ву Г., Ву Т, Цинь Р., Ван Ю. Визуальное обнаружение и дифференциация штаммов вируса классической чумы свиней с использованием амплификации на основе последовательности нуклеиновых кислот (NASBA) и анализа ДНКзима G-квадруплекса. Научный доклад (2017) 7: 44211. DOI: 10.1038 / srep44211

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

68.Zhai L, Liu H, Chen Q, Lu Z, Zhang C, Lv F и др. Разработка анализа амплификации на основе последовательностей нуклеиновых кислот в реальном времени для быстрого обнаружения сальмонелл. от еды. Braz J Microbiol. (2019) 50: 255–61. DOI: 10.1007 / s42770-018-0002-9

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

69. Хонсвалл Б.К., Робертсон Л.Дж. Анализ амплификации на основе последовательностей нуклеиновых кислот (NASBA) в реальном времени, нацеленный на MIC1, для обнаружения ооцист cryptosporidium parvum и cryptosporidium hominis. Exp Parasitol. (2017) 172: 61–7. DOI: 10.1016 / j.exppara.2016.12.009

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

70. Хео С., Ким Х.Р., Ли Х.Дж. Разработка количественного анализа на основе последовательности нуклеиновых кислот в реальном времени (NASBA) для раннего обнаружения вироида кожи яблочного рубца. Plant Pathol J. (2019) 35: 164–71. DOI: 10.5423 / PPJ.OA.10.2018.0206

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

71.Ма И, Дай Х, Хонг Т., Мунк Г.Б., Либера М. НАСБА на микрогеле-привязанном микрочипе с молекулярным маяком для микробной молекулярной диагностики в реальном времени. Аналитик. (2016) 142: 147–55. DOI: 10.1039 / C6AN02192A

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

72. Liu W, Li J, Wu Y, Xing S, Lai Y, Zhang G. Индуцированное мишенью лигирование близости запускает амплификацию полимеразы рекомбиназы и опосредованную транскрипцией амплификацию для обнаружения опухолевых экзосом в карциноме носоглотки с высокой чувствительностью. Biosens Bioelectron. (2018) 102: 204–10. DOI: 10.1016 / j.bios.2017.11.033

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

73. Ву Д., Тао С., Лю С., Чжоу Дж., Тан Д., Хоу З. Применение транскрипционной амплификации и полимеразной цепной реакции обратной транскрипции в реальном времени для обнаружения РНК вируса иммунодефицита человека. Чжун Нан Да Сюэ Бао И Сюэ Бань. (2017) 42: 776–82. DOI: 10.11817 / j.issn.1672-7347.2017.07.006

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

74.Ширато К., Семба С., Эль-Кафрави С.А., Хассан А.Х., Толах А.М., Такаяма I и др. Разработка флуоресцентной изотермической амплификации, опосредованной петлей обратной транскрипции (RT-LAMP), с использованием тушащих зондов для обнаружения коронавируса ближневосточного респираторного синдрома. J Virol Methods. (2018) 258: 41–8. DOI: 10.1016 / j.jviromet.2018.05.006

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

75. Ян Ц., Цуй Дж., Хуанг Л., Ду Б, Чен Л., Сюэ Дж. И др. Быстрое и визуальное обнаружение нового коронавируса 2019 года (SARS-CoV-2) с помощью анализа изотермической амплификации, опосредованного обратной транскрипцией. Clin Microbiol Infect. (2020) 26: 773–9. DOI: 10.1016 / j.cmi.2020.04.001

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

77. Ван Х, Чжун М., Лю И, Ма П, Данг Л., Мэн Кью и др. Быстрое и чувствительное обнаружение COVID-19 Использование обнаружения на основе CRISPR / Cas12a с считыванием невооруженным глазом, CRISPR / Cas12a-NER. Sci Bull. (2020) 65: 1436–9. DOI: 10.1016 / j.scib.2020.04.041

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

78.Пак Г-С, Ку К., Бэк С.-Х, Ким С.-Дж, Ким С.И., Ким Би-Т и др. Разработка методов изотермической амплификации, опосредованной обратной транскрипцией (RTLAMP), нацеленных на SARS-CoV-2. J Mol Diagn. (2020) 22: 729–35. DOI: 10.1101 / 2020.03.09.983064

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

79. Дахер Р.К., Стюарт Дж., Буассино М., Бержерон М.Г. Амплификация рекомбиназной полимеразы для диагностических приложений. Clin Chem. (2016) 62: 947–58. DOI: 10.1373 / Clinchem.2015.245829

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

81. Davi SD, Kissenkotter J, Faye M, Bohlken-Faschert S, Stahl-Henning C, Faye O, et al. Анализ амплификации рекомбиназной полимеразы для быстрого обнаружения вируса оспы обезьян. Diagn Microbiol Infect Dis. (2019) 95: 41–5. DOI: 10.1016 / j.diagmicrobio.2019.03.015

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

82. Chen C, Li X-N, Li G-X, Zhao L, Duan S-X, Yan T-F и др.Использование быстрого анализа амплификации с помощью рекомбиназы обратной транскрипции для обнаружения респираторно-синцитиального вируса. Diagn Microbiol Infect Dis. (2018) 90: 90–5. DOI: 10.1016 / j.diagmicrobio.2017.10.005

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

83. Ци Дж, Ли Х, Чжан И, Шэнь Х, Сонг Дж, Пан Дж и др. Разработка дуплексного теста амплификации с использованием рекомбиназы с обратной транскрипцией для респираторно-синцитиального вируса, включающего внутренний контроль. Arch Virol. (2019) 164: 1843–50. DOI: 10.1007 / s00705-019-04230-z

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

84. Ван Цюй, Ли Ф, Шен ХХ, Фу Ш, Хе И, Лэй У.В. и др. Анализ амплификации с использованием рекомбиназы с обратной транскрипцией для быстрого обнаружения дальневосточного подтипа вируса клещевого энцефалита. Biomed Environ Sci. (2019) 32: 357–62. DOI: 10.3967 / bes2019.047

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

85.Wang W, Wang C, Zhang P, Yao S, Liu J, Zhai X и др. Анализ амплификации с использованием рекомбиназы обратной транскрипции в сочетании с тест-полоской с боковым потоком для обнаружения вируса птичьего инфекционного бронхита. Poult Sci. (2019) 99: 89–94. DOI: 10.3382 / пс / pez559

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

86. Aydin S. Краткая история, принципы и типы ELISA, а также наш лабораторный опыт с анализами пептидов / белков с использованием ELISA. Пептиды. (2015) 72: 4–15. DOI: 10.1016 / j.peptides.2015.04.012

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

88. Xiang F, Wang X, He X, Peng Z, Yang B, Zhang J, et al. Обнаружение антител и динамические характеристики у пациентов с COVID-19. Клин Инфекция Дис . (2020) 19: ciaa461. DOI: 10.1093 / cid / ciaa461

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

92. Nielsen SCA, Yang F, Jackson KJL, Hoh RA, Roltgen K, Jean GH и др.Клональная экспансия В-клеток человека и ответы конвергентных антител на SARS-CoV-2. Клеточный микроб-хозяин. (2020) 28: 1–10. DOI: 10.1016 / j.chom.2020.09.002

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

94. Xu S, Xie S, Li Y, Feng J, Zhang S, Lye C, et al. Новый набор нуклеиновых кислот, способный быстро определять 2019-nCoV и применение. Патент Китая № 111 074 010. Шандун, Китай: Медицинский колледж Биньчжоу (2020).

Google Scholar

95.Гу Л., Ху В., Се Х, Се С., Донг Х, Чжан Дж. И др. Новая пара праймеров для обнаружения нуклеиновых кислот коронавируса с мутационной устойчивостью, набор и их применение. Патент Китая № 111 321 252. Жичжао, CN: Shandong Stars Bio-Industry Co. Ltd. (2020).

Google Scholar

96. Ян Дж., Ян С., Лю X, Дин В. Набор для обнаружения нуклеиновых кислот для нового коронавируса COVID-19 и метод его использования. Патент Китая № 111,118,228. Шанхай, Китай: Shanghai Bangxian Medical Tech Co. Ltd. (2020).

Google Scholar

97.Ван И, Донг Дж, Лин И, Ли К., Лю И, Чжан Х. Набор для цифровой ПЦР капельного типа для теста на нуклеиновую кислоту COVID-19 и применение набора. Патент Китая № 111,118,225. Сучжоу, Китай: Suzhou Rainsure Biological Tech Co. Ltd. (2020).

Google Scholar

98. Сонг М.С., Бэк Ю.Х. Наборы праймеров для обнаружения вирусов короны и их использования. Канвон, КР: Патент Республики Корея № 102,113,596. Bionics Co Ltd. (2020).

Google Scholar

99. Ван Кью, Ву Кью, Чжоу Ю., Цай З., Лу М., Чен Б. и др.Набор для быстрого обнаружения сухого порошка LAMP для SARS-CoV-2. Патент Китая № 111,154,922. Гуанчжоу, Китай: Guangdong Huankai Biotechnology Co. Ltd. (2020).

Google Scholar

100. Цуй С., Лян Л., Цзя И, Лян Р. Набор для быстрого обнаружения нового коронавируса с визуальной постоянной температурой. Патент Китая № 110 982 944. Пекин, Китай: Институт зоологии CAAS (2020).

PubMed Аннотация | Google Scholar

101. Инфантино М., Гросси В., Лари Б., Бэмби Р., Перри А., Маннески М. и др.Диагностическая точность автоматического хемилюминесцентного иммуноанализа на антитела IgM и IgG к SARS-CoV-2: опыт Италии. J Med Virol. (2020) 92: 1671–5. DOI: 10.1002 / jmv.25932

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

102. Липпи Г., Сальваньо Г.Л., Пегораро М., Милителло В., Калои С., Перетти А. и др. Оценка иммунного ответа на SARS-CoV-2 с помощью полностью автоматизированного хемилюминесцентного иммуноанализа MAGLUMI 2019-nCoV IgG и IgM. Clin Chem Lab Med .(2020). 58: 1156–9. DOI: 10.1515 / cclm-2020-0473

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

103. Xie J, Ding C, Li J, Wang Y, Guo H, Lu Z, et al. Характеристики пациентов с коронавирусной болезнью (COVID-19) подтверждены с помощью теста на антитела IgM-IgG. J Med Virol . (2020) 92: 2004–10. DOI: 10.1002 / jmv.25930

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

104. Cai X-F, Chen J, Hu J-L, Long Q-X, Deng H-J, Fan K и др.Иммуноферментный магнитный хемилюминесцентный анализ на основе пептидов для серологической диагностики коронавирусной болезни 2019 (COVID-19). Дж. Заразить Дис . (2020) 8: jiaa243. DOI: 10.1093 / infdis / jiaa243

CrossRef Полный текст | Google Scholar

105. Long Q-X, Deng H-J, Chen J, Hu J, Liu B-Z, Lia P и др. Антительный ответ на SARS-CoV-2 у пациентов с COVID-19: перспективное применение серологических тестов в клинической практике. medRxiv . (2020) 1: 1–20. DOI: 10.1101 / 2020.03.18.20038018

CrossRef Полный текст | Google Scholar

106. Сунь Б., Фэн И, Мо Х, Чжэн П., Ван Ц., Ли П. и др. Кинетика специфических для SARS-CoV-2 ответов IgM и IgG у пациентов с COVID-19. Emerg Microbes Infect. (2020) 9: 940–8. DOI: 10.1080 / 22221751.2020.1762515

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

107. Штадлбауэр Д., Аманат Ф., Хромикова В., Цзян К., Стромайер С., Арункумар Г.А. и др. Сероконверсия SARS-CoV-2 у людей: подробный протокол серологического анализа, продукции антигена и настройки тестирования. Curr Protoc Microbiol. (2020) 57: e100. DOI: 10.1002 / cpmc.100

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

108. Woo PCY, Lau SKP, Wong BHL, Tsoi H-W, Fung AMY, Kao RYT и др. Дифференциальная чувствительность при тяжелом остром респираторном синдроме (SARS), иммуносорбентный иммуноферментный анализ спайк-полипептида коронавируса (ELISA) и ELISA на нуклеокапсидный белок коронавируса SARS для серодиагностики пневмонии, вызванной коронавирусом SARS. J Clin Microbiol. (2005) 43: 3054–8.DOI: 10.1128 / JCM.43.7.3054-3058.2005

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

109. Чжао Р., Ли М., Сонг Х., Чен Дж., Рен В., Фэн Ю. и др. Раннее выявление антител SARS-CoV-2 у пациентов с COVID-19 как серологического маркера инфекции. Клин Инфекция Дис . (2020) 1: ciaa523. DOI: 10.1093 / cid / ciaa523

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

110. Эсбин М.Н., Уитни О.Н., Чонг С., Маурер А., Дарзак Х, Тьянь Р.Преодоление узкого места в широкомасштабном тестировании: быстрый обзор подходов к тестированию на нуклеиновые кислоты для обнаружения COVID-19. РНК . (2020) 26: 771–83. DOI: 10.1261 / rna.076232.120

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

111. Abbott TR, Dhamdhere G, Liu Y, Lin X, Goudy L, Zeng L, et al. Разработка CRISPR как противовирусной стратегии борьбы с SARS-CoV-2 и гриппом. Ячейка . (2020) 181: 865–76.e12. DOI: 10.1016 / j.cell.2020.04.020

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

112.Маккарти MW. Использование потенциала платформ на основе CRISPR для развития больничной медицины. Expert Rev Anti Infect Ther. (2020) 2020: 1–7. DOI: 10.1080 / 14787210.2020.1761333

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

113. Ван С., Хуанг Б., Ма Х, Лю П, Ван И, Чжан Х и др. Анализ амплификации с использованием рекомбиназы обратной транскрипции для вируса птичьего гриппа подтипа H7. Transbound Emerg Dis. (2020) 67: 877–83. DOI: 10.1111 / т. 13411

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

114. Раваль Дж. С., Бернетт А. Е., Роллинз-Раваль М. А., Григгс Дж. Р., Розенбаум Л., Нильсен Н. Д. и др. Тестирование вязкоупругости при COVID-19: возможный инструмент скрининга на тяжелое заболевание? Переливание. (2020) 6: 1131–2. DOI: 10.1111 / trf.15847

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

116. Пэк Й. Х., Эм Дж., Антигуа, К. Джей Си, Пак Дж. Х., Ким Й, О С. и др. Разработка изотермической амплификации, опосредованной обратной транскрипцией, как быстрого метода раннего обнаружения нового SARS-CoV-2. Заболевшие микробы заражают . (2020) 9: 998–1007. DOI: 10.1080 / 22221751.2020.1756698

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

117. Лу Р, Ву Х, Ван З, Ли И, Цзо Л, Цинь Дж и др. Поправка к: разработке нового метода изотермической амплификации, опосредованного обратной транскрипцией, для быстрого обнаружения SARS-CoV-2. Вирол Син . (2020) 35: 344–7. DOI: 10.1007 / s12250-020-00218-1

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

118.Хуанг В.Е., Лим Б., Сюй С-С, Сюн Д., Ву В., Юй и др. RT-LAMP для быстрой диагностики коронавируса SARS-CoV-2. Микроб Биотехнология . (2020) 13: 950–61. DOI: 10.1111 / 1751-7915.13586

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

119. Yu L, Wu S., Hao X, Dong X, Mao L, Pelechano V, et al. Быстрое обнаружение коронавируса COVID-19 с использованием диагностической платформы изотермической амплификации, опосредованной обратной транскрипцией (RT-LAMP). Clin Chem . (2020) 66: 975–7.DOI: 10.1093 / Clinchem / hvaa102

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

120. Fu W, Chen Q, Wang T. Письмо в редакцию: три случая повторно обнаруживаемой положительной РНК SARS-CoV-2 у выздоровевших пациентов с COVID-19 с антителами. J Med Virol . (2020) 92: 2298–301. DOI: 10.1002 / jmv.25968

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

122. Тил Е.С., Слев П., Уилер С., Кутюрье М.Р., Вонг С.Дж., Кадхода К. Роль тестирования антител на SARS-CoV-2: есть ли оно? Дж. Клин Микробиол .(2020) 58: e00797–20. DOI: 10.1128 / JCM.00797-20

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

123. Пето Дж., Алван Н. А., Годфри К. М., Берджесс Р. А., Хантер Д. Д., Риболи Е. и др. Универсальное еженедельное тестирование в качестве стратегии выхода из режима блокировки COVID-19 в Великобритании. Ланцет. (2020) 395: 1420–21. DOI: 10.1016 / S0140-6736 (20) 30936-3

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

126. Юнес Н., Аль-Садек Д.В., Аль-Джигефи Х., Юнес С., Аль-Джамаль О., Даас Н.И. и др.Проблемы лабораторной диагностики нового коронавируса SARS-CoV-2. вирусов. (2020) 12: 582. DOI: 10.3390 / v12060582

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

128. Ян В., Данг Х, Ван Ц., Сюй М., Чжао Ц., Чжоу Ц. и др. Быстрое обнаружение SARS-CoV-2 методом обратной транскрипции RT-Lamp. medRxiv. (2020) 3: 1–25. DOI: 10.1101 / 2020.03.02.20030130

CrossRef Полный текст | Google Scholar

129. Лауэр С.А., Грантц К.Х., Би К., Джонс Ф.К., Чжэн К., Мередит Х.Р. и др.Инкубационный период коронавирусной болезни 2019 (COVID-19) из официально зарегистрированных подтвержденных случаев: оценка и применение. Ann Intern Med. (2020) 172: 577–82. DOI: 10.7326 / M20-0504

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

131. Насименто-Хуниор Х.А.К., Сантос А.М., Кинтанс-Хуниор Л.Дж., Уокер С.И.Б., Борхес Л.П., Серафини М.Р. и др. Лечение SARS, MERS и SARS-CoV-2 (COVID-19): обзор патента. Мнение эксперта Ther Pat. (2020) 30: 567–79.DOI: 10.1080 / 13543776.2020.1772231

CrossRef Полный текст | Google Scholar