Быстрый тюнинг: Ошибка 404. Нет такой страницы

Следите за новостями в Twitter и Instagram, нажмите «Нравится» на нашей странице в Facebook и подпишитесь на наш канал в YouTube.

*ДЕЙСТВУЮТ ОПРЕДЕЛЁННЫЕ УСЛОВИЯ, ОГРАНИЧЕНИЯ И ИСКЛЮЧЕНИЯ.  ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЕ СВЕДЕНИЯ СМ. НА СТРАНИЦАХ ea.com/ru-ru/ea-access/terms И origin.com/store/origin-access/terms.

**ДЕЙСТВУЮТ ОПРЕДЕЛЕННЫЕ ПРАВИЛА И ОГРАНИЧЕНИЯ. ПОДРОБНОСТИ ПО ССЫЛКЕ: www.ea.com/ru-ru/games/need-for-speed/need-for-speed-heat/pre-order-disclaimers.

Manhant Performance создали тюнинг проект Lamborghini Urus

Немецкое тюнинг-ателье взялось за доработку одного из самых быстрых кроссоверов мира.

Многие думают, что эта машина итак является практически идеальной во всех планах. Многие, но не немецкие инженеры из тюнинг-ателье Manhant Performance. Их не устроило, что «стоковый» кроссовер, обладающий 4-литровым V8 с двойным турбонаддувом реализовывает 650 л.с. и 850 Нм максимального крутящего момента. Они решили внести свои коррективы, в результате которых с мотора удалось «снять» 812 л.с. и 980 Нм. Причем улучшений удалось добиться путем перепрограммирования электронного блока управления двигателем, установки более производительных турбин и доработки выпускной системы. Естественно, 8-ступенчатая автоматическая коробка подверглась качественной доработке. Прирост л.с составил примерную мощность 1,5-литровой Mazda MX-5. А мощность доработанной версии теперь превосходит своего «спортивного» собрата по марке Lamborghini Aventador SVJ, чей благородный атмосферный 6,5-литровый V12 способен реализовать 770 л.с. и 720 Нм крутящего момента.

Выпущенный с завода Lamborghni Urus может разгоняться с места до 100 км/ч всего за 3,6 секунды. Это весьма нескромный показатель, тем более для кроссовера. Максимальная скорость ограничена электроникой и составляет 305 км/ч. К сожалению, инженеры Manhant Performance не сообщили точных данных своей «доработки», но складывается впечатление, что она покажет куда лучший результат, чем «заводской» вариант модели.

Также изменения коснулись и экстерьера. Новый Lamborghni Urus получил карбоновый капот и аэродинамический кузовной обвес, тоже из углеволокна. Он представлен передним сплиттером, расширителями колесных арок, переработанными «жабрами» передних крыльев, накладками на пороги, задним спойлером и задним же диффузором. Цветовое оформление кузова претерпело значительные изменения: добавилось множество черных акцентов. Зеркала заднего вида, пластиковые накладки на бампера и наклейки в виде полос по всему кузову. Черными стали и 21-дюймовые эксклюзивные диски с низкопрофильной резиной Pirelli P-Zero.

Тюнинг. Закись азота – быстрый результат

Закись азота, NOS (от англ. Nitrous Oxide System) или, по-простому, нитрос – это химическое соединение,  являющееся дополнительным окислителем топлива. Из-за высокой температуры в камере сгорания происходит разложении N2O на кислород и азот. Для справки: в состав закиси азота входит 36% кислорода, то есть почти в 2 раза больше, чем в воздухе. Автомобильное топливо сгорает эффективнее, давление в цилиндрах увеличивается, что и приводит в скачку мощности. При этом есть дополнительный плюс – азот препятствует детонации.

Если необходимость  форсирования двигателя возникает нечасто, например, при старте или обгоне, хорошей альтернативой механическому тюнингу будет оснащение автомобиля закисью азота.  Прирост «лошадиных сил» происходит только при кратковременном впрыске состава во впускной коллектор,  а в остальное время машина остается обычным средством передвижения с установленной мощностью и без перерасхода топлива. Система проста в установке и может быть легко демонтирована, имеет демократичную стоимость по сравнению с другими инструментами тюнинга двигателя.

Существует 3 вида систем  впрыска: сухая, мокрая, системе прямого впрыска (но это отдельная тема). Безусловно, при выборе системы нельзя превышать возможности двигателя Субару, в противном случае возникает риск выхода его из строя.

И в заключении хотим еще раз напомнить, что планируя проведение тюнинга, необходимо составить точную схему работ, чтобы не ухудшить имеющиеся технические характеристики.

В представленном цикле статей мы постарались коснуться основных видов тюнинга двигателя Субару. Но даже в таком большом материале невозможно осветить все технические нюансы.

Если у вас появились вопросы, пожалуйста, обращайтесь. Вы всегда сможете проконсультироваться со специалистами сервиса «Субару на Лихоборке» по телефону +7 (925) 041-97-17 или электронной почте: [email protected].

По мере готовности остальных статей вы сможете перейти к нужному разделу по ссылке из Оглавления:

1. Виды тюнинга
2. Диагностика и ремонт двигателя – первый шаг к тюнингу
3. Чип-тюнинг Субару, экономично и эффективно
4. Установка турбины Субару
5. Тюнинг топливной системы Субару
6. Настройка выхлопной системы Субару как необходимый этап для тюнинга двигателя
7. Мелкий подготовительный тюнинг
8. Тюнинг двигателя: повышение параметров надежности
9. Новый коленвал, поршни и шатуны Субару – новые возможности
10. Строкер-кит и гильзовка
11. Спортивный распредвал для Субару
12. Закись азота – быстрый результат

Гидрокрыло (тюнинг ПЛМ для мотолодки).

Поиск

Гидрокрыло (антикавитационное крыло) можно отнести к тюнингу Вашего ПЛМ (моторной лодки или катера). Гидрокрыло крепится на кавитационной плите в нижней части сапога ПЛМ, под водой. Каждый владелец подвесного лодочного мотора не раз задумывался над целесообразностью тюнинга. Иногда, выйдя на воду можно увидеть точно такую же технику как и у Вас, точно такой же мотор, который ведет себя по-другому. Возникают вопрос, например: почему лодка с таким же мотором и количеством людей на борту быстрее выходит на глиссирование?

Возможно, все дело в приспособлении для лодочного мотора с загадочным названием «hydrofoil» или «антикавитационное крыло» (название получено от места установки — антикавитационная плита).

Русскоязычных названий у крыльев несколько:

— антикавитационные крылья,
— гидрокрылья,
— гидростабилизатор,
— подводные крылья.

Визуально гидрокрылья можно разделить на два типа — монокрыло и стандартные крылья состоящие из двух частей. По размеру приспособления делятся на три типоразмера — для моторов до 30л.с., для моторов до 50л.с. и для моторов свыше 50л.с. Монокрылья рекомендуется устанавливать на лодочные моторы средней и высокой мощности от 50л.с. Монтаж любой модели крыльев достаточно прост: необходимо просверлить 4 отверстия в антикавитационной плите мотора, и закрепить крылья болтами.

Технические задачи, которые можно решить, установкой гидрокрыла:

1. Устранение режима дильфинирования. Когда на глиссирующем катере или мотолодке идешь по короткой волне выжимая, все имеющиеся лошади из своего ПЛМ (двигатель периодически издает звуки, как будто винт вытащили из воды и происходит сброс скорости). Этот режим часто сопровождается прорывом воздуха к винту, что приводит к эффекту временной кавитации винта и скоростному рывку на подхвате. Гидрокрыло позволяет полностью устранить этот эффект.

2. Гидрокрыло минимизирует этот вынос при движении катера или мотолодки в повороте или развороте и проскальзывание (вынос корпуса наружу радиуса поворота), давая возможность совершить спортивный разворот (поворот).

3. Гидрокрыло помогает более быстрому выходу на глиссер, однако стоит отметить что особо рассчитывать на эту способность не следует, эффект слишком незначителен. Гидрокрыло не заменит транцевые плиты.

Стоит добавить, что популярность гидрокрыльев растет. Появляются новые, совершенные модели. Бывают специальные гидрокрылья для троллинга, складывающиеся в направлении винта и создающие дополнительное сопротивление, движению катера, замедляя его скорость. Возможно, что гидрокрылья в РФ станут такими же популярными как в Финляндии, где можно встретить множество разнообразных моделей, в том числе и самодельного производства.

Подводя итоги можно сказать, что основным плюсом гидрокрыльев является обеспечение более быстрого выхода в режим глиссирования(время сокращается на 10-15%). Также применение крыльев увеличивает площадь антикавитационной плиты, что улучшает курсовую устойчивость хода лодки. Основным минусом антикавитационных крыльев можно назвать небольшое снижение скорости на 3-5%, но если стоит проблема выхода на глиссирование из-за увеличенного кормового дифферента (центр тяжести лодки смещен в заднюю часть), то установка гидрокрыльев может решить проблему. После установки крыльев центр тяжести смещается и нос лодки опускается, убирая эффект свечки.

Хотелось бы дать совет — если нет проблем с выходом на глиссирование и кормовым дифферентом, то не нужно устанавливать антикавитационные крылья в качестве эстетического аксессуара.

Быстрая настройка двойного резонанса Фано с использованием метаматериала с фазовым переходом при малой мощности

Адаптивная настройка скорости мутаций позволяет быстро реагировать на летальный стресс у Escherichia coli

Рецензент № 1:

Этот обзор сделан с точки зрения «широкой аудитории», неформально интересующейся мутаторами.Эта статья показала, что, когда E. coli подвергалась летальному воздействию этанола, мутаторы развивались в нескольких линиях. Эти мутаторные линии (но не линии с нормальным уровнем мутаций) могут переносить летальные уровни этанола. На более поздних стадиях эволюции частота мутаций в этих линиях мутаторов была снижена.

Авторы утверждают, что «скорость мутации организма часто считается медленно меняющимся параметром». Я не уверен, верно ли это утверждение, поскольку Wielgoss et al., 2013 показали, что гипер-мутатор развился в одной из 12 линий Ленски и что позже он был заменен более мягкими мутаторами.Разница в том, что в этом исследовании снижение частоты мутаций происходит за счет компенсаторных мутаций вместо замены одного типа мутатора другим типом. Hammerstrom et al. (2015) (не цитируется) показали, что гипермутаторы могут неоднократно развиваться в ответ на тигециклин (через вставку транспозона). Таким образом, повторная эволюция гипермутатора (в отличие от случайного появления мутатора в одной из линий Ленского) также не нова. Однако в этой статье есть интересные эксперименты, и динамика частоты мутаций также отслеживается с прекрасным разрешением.

Мы благодарим рецензента за высокую оценку нашей работы, а также за подробные исправления и предложения, которые были внесены для дальнейшего улучшения рукописи.

Wielgoss et al. , 2013 действительно сообщили о появлении гипермутатора и более позднем снижении частоты мутаций в одной из линий Ленски. Однако в свете их работы мы по-прежнему считаем, что наше утверждение о том, что частота мутаций является медленно развивающимся параметром, верно, поскольку это увеличение и последующее снижение происходило в течение длительного периода времени (± 40 000 поколений или 20 лет) и наблюдалось в только одна репликация населения.Кроме того, как также указал рецензент 3, считается, что гораздо более низкие коэффициенты отбора стимулируют отбор генотипов с более низкой частотой мутаций и наблюдались в исследованиях без стресса или в условиях умеренного стресса (Wielgoss et al. , 2013; Sniegowski, Герриш и Ленски, 1997; Баррик и др. , 2009; Сандберг и др. , 2014). В целом, мы считаем, что можно утверждать, что скорость мутации организма часто считается медленно меняющимся параметром.

Спасибо, что указали на Hammerstrom et al. , которое показывает повторяющуюся эволюцию гипермутаторов A. baumannii в ответ на лечение тигециклином (Hammerstrom et al. , 2015). Это демонстрирует, что наши наблюдения гипермутации во всех линиях с высокой толерантностью к этанолу не ограничиваются почти летальным этанольным стрессом, но лежат в основе более широкого феномена, когда клетки, подвергшиеся экстремальному стрессу (включая этанол или антибиотики), предпочитают более высокую частоту мутаций, чтобы избежать исчезновения.Поскольку эта превосходная работа подтверждает клиническую значимость нашего исследования, мы процитировали ссылку 36 и обсудили ее как в разделах «Введение», так и в раздел «Обсуждение» исправленной рукописи.

Однако мы считаем, что наши результаты выходят далеко за рамки исследования Hammerstrom et al. Мы не только описываем быструю, повторяющуюся эволюцию гипермутации в каждой линии с высокой толерантностью к этанолу, но также и эволюцию множественных, последовательных повышений и понижений частоты мутаций в пределах одной и той же эволюционной линии.Насколько нам известно, такого динамичного изменения частоты мутаций с течением времени никогда раньше не наблюдалось. Чтобы подчеркнуть разницу между повторяющейся эволюцией гипермутации во всех линиях с высокой толерантностью к этанолу и повторяющимся увеличением и уменьшением, наблюдаемым внутри линии, мы изменили реферат, чтобы подчеркнуть основные результаты нашего исследования.

«[…] Напротив, мы демонстрируем неожиданную гибкость в скорости клеточных мутаций в ответ на изменения давления отбора. Мы показываем, что гипермутация независимо развивается, когда разные культуры Escherichia coli адаптируются к высокому этанольному стрессу.Кроме того, состояния гипермутации преходящи и часто чередуются с уменьшением частоты мутаций. В частности, частота мутаций увеличивается, когда клетки испытывают более высокий стресс, и снова снижается, когда клетки адаптируются. […] »

Основные пункты:

Подраздел «Долгосрочная адаптация к высокой концентрации этанола у E. coli зависит от гипермутации»: «эволюционные тупики» — откуда вы это знаете? Вы вводили мутации-мутаторы в тупиковые линии и наблюдали отсутствие улучшенной выживаемости этанола? Если так, то будет интересно узнать, почему «тупиковые» линии не смогли развить мутаторные фенотипы.

Мы не вводили мутаторную мутацию обратно в эти тупиковые линии. Поэтому мы удалили и перефразировали термин «эволюционные тупики», чтобы описать эти линии с низкой толерантностью к этанолу в рукописи.

«[…] Хотя толерантность к этанолу увеличилась во всех популяциях, только восемь из 20 линий развили толерантность к очень высоким (7% и более) концентрациям этанола (рис. 2B), в то время как другие 12 линий периодически вымирают и развивают толерантность только к относительно низкие концентрации этанола (6% или ниже).[…] »

«[…] Если для роста штамму требовалось более 14 дней, мы предполагали, что эта популяция вымерла. […]»

«[…] Если штамм не показал роста в течение 14 дней, мы предположили, что линия вымерла, и мы восстановили предыдущую сохраненную промежуточную точку, чтобы возобновить эволюцию. […]»

Хотя у нас нет прямых доказательств, введение мутации-мутатора могло бы позволить этим линиям еще больше адаптироваться к более высоким уровням стресса. Чтобы лучше понять, почему эти линии не развили мутаторный фенотип, мы секвенировали 2 линии с низкой толерантностью (E4 и E17).Обе эти линии накопили мутацию в fabA , гене, участвующем в биосинтезе жирных кислот, который уже был связан с более высокой толерантностью к этанолу (Dombek and Ingram, 1984; Luo, et al. , 2009). Однако линия E4 дополнительно содержала мутацию в rpoZ , а линия E17 накапливала дополнительную делецию infB . rpoZ кодирует субъединицу РНК-полимеразы и играет роль в транскрипции, тогда как infB кодирует фактор инициации белковой цепи и играет роль в трансляции.Недавно было показано, что этанол влияет как на транскрипцию, так и на трансляцию в клетке (Haft, et al. , 2014). Хотя это и является предположением, влияние этих специфических мутаций может серьезно ухудшить рост этих низкотолерантных линий при более высоком процентном содержании этанола, предотвращая возникновение мутаторных мутаций или других и, таким образом, дальнейшее эволюционное улучшение. Мы включили это в раздел «Обсуждение»:

«[…] Несмотря на то, что мы в основном сосредоточились на увеличении частоты мутаций в этом исследовании, 12 медленно мутирующих линий с низкой толерантностью к этанолу могут быть интересной отправной точкой для дальнейших исследований.Отсутствие гипермутации в этих линиях, по-видимому, препятствует дальнейшей адаптации к высоким концентрациям этанола. Анализ последовательности двух из этих линий выявил наличие мутаций в rpoZ (субъединица РНК-полимеразы) и infB (фактор инициации белковой цепи) в линиях E4 и E17 соответственно. Поскольку этанол токсичен из-за своего воздействия на транскрипцию и трансляцию (Haft, et al. , 2014), нарушение транскрипционного или трансляционного аппарата из-за этих мутаций может вызвать повышенную чувствительность к более высоким уровням этанола.Это предотвратит дальнейший рост и возможность приобретения мутаторного аллеля или любой другой мутации. Хотя у нас нет доказательств того, что мутации rpoZ и infB являются причиной снижения частоты мутаций, эти мутации интересны и могут объяснить отсутствие дальнейшего улучшения адаптации в линиях E4 и E17 (Рисунок 3A). […] ”

Необходимо описать метод количественной оценки толерантности к этанолу. Рисунок 5B: Единицы? На самом деле я не уверен в сути рисунка 5B, учитывая, что высокая толерантность к этанолу может быть достигнута с низкой частотой мутаций на более поздних стадиях эволюции.

Толерантность популяции к этанолу измерялась как способность расти в жидкой среде в присутствии определенного процента этанола. Когда популяция росла и достигла оптической плотности 0,2 или более в присутствии определенного процента этанола, она считалась толерантной к этому проценту. Чтобы гарантировать правильное процентное содержание этанола в среде, мы использовали систему анализа пива Alcolyser (Anton Paar GmbH, Австрия). Теперь мы уточнили количественную оценку толерантности к этанолу и измерение концентрации этанола в разделе «Материалы и методы».

«[…] Для обеспечения правильного процентного содержания этанола, добавляемого в среду, мы использовали систему анализа пива Alcolyser (Anton Paar GmbH, Австрия). […]»

«[…] Устойчивость популяции к этанолу измерялась как способность расти в жидкой среде в присутствии определенного процента этанола до оптической плотности не менее 0,2. […]»

Мы также добавили единицы измерения на рис. 5B.

Данные, представленные на рисунке 5B, доказывают, что динамика скорости мутаций лежит в основе эволюции толерантности к этанолу.Нет корреляции между абсолютной частотой мутаций в каждой точке и абсолютной толерантностью к этанолу в каждой точке. Вместо этого этот рисунок показывает, что увеличение частоты мутаций между двумя последовательными точками в значительной степени коррелирует с увеличением толерантности к этанолу между этими двумя временными точками, указывая на то, что мутация-мутатор (которая вызывает увеличение скорости мутаций) автостопом с полезной мутацией (которая вызывает повышенная толерантность к этанолу) и что эти полезные мутации имеют более высокую вероятность возникновения на фоне мутатора.Более того, снижение частоты мутаций (отрицательная Δ частота мутаций) коррелирует с периодами постоянного давления этанола (Δ толерантность к этанолу равна нулю), показывая, что частота мутаций снова уменьшается, когда популяция способна расти в присутствии определенного процента этанола. Эта корреляционная информация отсутствует на рисунке 5A, что показывает актуальность дополнительной панели.

Я не считаю повышенный уровень смертности, связанный с мутаторами, особенно интересным, если бы авторы не объяснили мне фундаментальную разницу между более медленным рождением, повышенной смертностью или их комбинацией.В конце концов, можно рассматривать рождение и смерть как «чистый рост».

Мы согласны с тем, что рост популяции зависит как от рождения, так и от смерти клеток в популяции. Поэтому мы добавили несколько строк в раздел «Результаты», чтобы уточнить, что наши наблюдения связаны с увеличением смертности, а не с более медленным рождением.

«[…] Удивительно, но все протестированные промежуточные точки показали очень быстрое уменьшение количества жизнеспособных клеток при переходе в стационарную фазу (Рисунок 6 — рисунок в приложении 1).Это уменьшение количества жизнеспособных клеток объясняется действительно повышенной смертностью в популяции, поскольку клетки находятся в стационарной фазе. […] »

Кроме того, высевая растущие популяции в разные моменты времени, мы смогли наблюдать уменьшение жизнеспособных клеток (то есть отрицательный чистый рост), начиная с ранней стационарной фазы. Поскольку рождение клеток уже отсутствует или низкое в стационарной фазе, уменьшение количества жизнеспособных клеток объясняется повышенной гибелью клеток. Более того, мы смогли подтвердить повышенную смертность из-за окрашивания мертвых животных (Рисунок 6; Рисунок 6 — приложение к рисунку 1; Рисунок 6 — приложение к рисунку 2).

Я не понимаю суть таблицы 1. Почему бы не пересчитать предполагаемое количество мутаций на основе динамики скорости мутаций и посмотреть, соответствует ли оно наблюдаемому количеству мутаций?

Таблица 1 должна была показать несоответствие между ожидаемым количеством мутаций, основанным на частоте мутаций конечной точки, и фактическим количеством фиксированных мутаций, эффективно наблюдаемых в геномной последовательности конечных точек. Интересное предложение пересчитать количество мутаций на основе динамики скорости мутаций.Мы попытались рассчитать площадь под кривой (AUC) на рисунке 5A, чтобы получить приблизительное количество мутаций за период времени, принимая во внимание колебания скорости мутаций в каждый момент времени. Однако этот расчет слишком упрощен. Скорость геномных мутаций, измеренная с помощью анализов флуктуаций, не подходит для расчета оценок, которые будут сравниваться с истинным числом фиксированных мутаций. Скорость геномных мутаций отражает только количество мутаций, встречающихся в популяции, но не дает оценки количества мутаций, которые в конечном итоге закрепятся в популяции.Создание надлежащего приближения ожидаемого количества мутаций потребует оценки частоты полезных мутаций и вероятности фиксации мутации в данной среде. Было бы чрезвычайно сложно сделать это в нашей конкретной установке, поскольку мы, например, не использовали постоянную среду, а вместо этого постоянно увеличивали процентное содержание этанола. Кроме того, расчеты необходимых параметров для получения достоверной оценки будут различаться для каждого момента времени, что делает его чрезвычайно сложным.Поэтому мы решили удалить столбец с предполагаемым количеством мутаций и заменить таблицу дополнительным показателем, показывающим как общее количество вариантов в популяции, так и количество фиксированных мутаций (Рисунок 2 — Рисунок 2). Этот дополнительный рисунок хорошо показывает, что мутационный профиль популяций мутаторов сложен с несколькими низкочастотными мутациями, которые принадлежат разным субпопуляциям, возможно, с более высокой или более низкой частотой мутаций, чем средняя частота мутаций в популяции.

Было бы интересно узнать, какие мутации напрямую способствуют толерантности к этанолу (если у вас уже есть данные).

Идентификация мутаций, которые напрямую способствуют толерантности к этанолу, является чрезвычайно сложной задачей в нашем наборе данных, учитывая вероятное большое количество мутаций-пассажиров среди нескольких мутаций драйвера. Однако в настоящее время мы разрабатываем метод анализа таких очень сложных наборов данных о мутациях, часто возникающих в результате эволюции гипермутаторов. Глядя на параллелизм между эволюционировавшими линиями, мы уже смогли идентифицировать путь биосинтеза жирных кислот, кодируемый генами fab, как главную мишень в начальной адаптации к высокому этанольному стрессу.Идентификация этого пути служит истинным положительным моментом для нашего анализа, поскольку изменение состава жирных кислот мембраны ранее сообщалось как основной механизм, способствующий толерантности к этанолу (Dombek and Ingram, 1984; Luo, et al. , 2009). .

Рецензент № 2:

В своей рукописи, озаглавленной «Адаптивная настройка скорости мутаций позволяет быстро реагировать на летальный стресс у E. coli», Toon Swings и сотрудники изучают эволюцию скорости мутаций при адаптации к этанолу.Они показывают, что на ранних стадиях адаптации быстро выбирается повышенная частота мутаций, и, что более удивительно, они обнаруживают быстрое снижение частоты мутаций, которое, по-видимому, напрямую связано с некоторым увеличением смертности. Данные надежные, количественные и очень интересные, особенно связь между смертностью и уровнем мутаций. Мои комментарии в основном касаются некоторых интерпретаций результатов и некоторых экспериментальных деталей

Во Введении не совсем ясно, является ли 5% этанол настоящим смертельным стрессом: мутации необходимы, чтобы выжить в первом цикле роста.Судя по времени задержки, кажется, что это так. Если это так, то в статье будет полезно сослаться на область экспериментов по спасению. Это модные эксперименты, изучающие адаптацию в условиях, в которых она необходима для выживания. Параграф (или даже заголовок) о связи между экспериментом и этим полем увеличит читательскую аудиторию статьи.

Мы согласны с рецензентом и включили концепцию эволюционного спасения и связь с гипермутацией в разделы «Введение» и «Обсуждение».

«[…] Это особенно очевидно в суровых условиях, где почти смертельный стресс требует быстрой адаптации по крайней мере некоторых особей, чтобы избежать полного исчезновения популяции (Bell and Gonzalez, 2011). Достаточно быстрая адаптация, позволяющая спасти популяцию от вымирания, ведет к так называемому эволюционному спасению. Это явление широко изучается в свете изменения климата и адаптации сокращающихся популяций к новым, меняющимся условиям окружающей среды (Lindsey, et al. , 2013).Это происходит, когда популяция, находящаяся в состоянии стресса, не обладает достаточной фенотипической пластичностью и может избежать вымирания только благодаря генетическим изменениям (Gonzalez, et al. , 2013). Эволюционное спасение зависит от различных факторов, таких как размер популяции, размер генома, частота мутаций, степень изменения окружающей среды и история стресса (Gonzalez, et al. , 2013; Gonzalez and Bell, 2012). Увеличивая количество мутаций, гипермутации также могут иметь решающее значение для эволюционного спасения популяций, находящихся в условиях смертельного стресса.[…] »

«[…] Несмотря на бремя дополнительных, возможно, летальных мутаций, увеличение количества мутаций обеспечивает быструю адаптацию по крайней мере некоторых особей и спасает популяцию от вымирания (Bell and Gonzalez, 2011; Lindsey et al. , 2013; Gonzalez и др. , 2013; Гонсалес и Белл, 2013). […] ”

Эволюционное спасение — действительно интересный феномен, который очень важен для адаптации к летальному стрессу. 5% этанол почти полностью подавляет рост дикого типа и резко снижает несущую способность (рисунок 1 — приложение к рисунку 2).Различное время задержки, наблюдаемое как у мутантов дикого типа, так и у мутантных мутантов, действительно предполагает, что мутации необходимы для обеспечения роста в присутствии 5% этанола, что, следовательно, может означать, что это настоящий летальный стресс. Однако, чтобы подтвердить это утверждение, нам нужно будет секвенировать штамм после выращивания на 5% этаноле, чтобы увидеть, действительно ли мы можем идентифицировать адаптивные мутации, которые способствовали росту и спасли популяцию от вымирания.

Следует отметить, что предыдущие исследования показали, что повышение толерантности к этанолу является сложным процессом, включает взаимодействие между множеством генов и путей и требует множественных мутаций (Goodarzi, et al., 2010; Николау, и др. , 2012; Voordeckers, et al. , 2015). Необходимость множественных мутаций для достижения более высокой толерантности к этанолу в сочетании с серьезным нарушением роста при 5% этаноле резко ограничивает возможность приобретения адаптивных мутаций. Таким образом, мы считаем, что увеличение частоты мутаций — единственная возможность сгенерировать достаточное количество генетических вариаций во времени, чтобы обеспечить адаптацию и избежать исчезновения. Хотя эволюционное спасение во многом зависит от частоты мутаций (Gonzalez, et al., 2013; Gonzalez and Bell, 2012), возникновение гипермутации в связи с эволюционным спасением подробно не обсуждалось. Возможно, потому что для эволюционного спасения с помощью гипермутации требуются два мутационных события: возникновение мутации-мутатора и возникновение адаптивной мутации, спасающей популяцию. Возникновение гипермутации во всех наших линиях с высокой толерантностью к этанолу и повторяющиеся увеличения и уменьшения частоты мутаций, которые соответствуют изменениям давления этанола во время эволюции, демонстрируют, что гипермутация имеет решающее значение для быстрой адаптации по крайней мере некоторых особей и спасения популяции от вымирания в условиях стрессовые состояния, близкие к летальному исходу.

В документе четко показан новый фактор, который может объяснить изменения в частоте мутаций: смертность. Однако вся интерпретация явления все еще связана с идеей отбора и нагрузки второго порядка. Это действительно соответствует первым теоретическим данным о мутаторах и отборе второго порядка, в котором не учитывались все возможные прямые эффекты. В более поздних работах больше внимания уделяется потенциальным прямым эффектам, и я думаю, что обсуждение должно представить некоторые из этих идей и, в конечном итоге, оспорить их.Некоторые результаты здесь предполагают, что в конечном итоге некоторое прямое влияние мутаторов может сказаться не на раннем отборе мутаторов, а в конечном итоге на их стоимости.

Сначала на рисунке 4 даже при очень низких частотах отбираются мутаторные аллели. Это довольно удивительно, поскольку в какой-то момент субпопуляция мутаторов должна быть слишком низкой, чтобы генерировать какие-либо полезные мутации. Действительно, если мы предположим 1000-кратный эффект на переходы, мутатор должен уступить место дикому типу в соотношении 1/10000 или около того.Итак, рисунок 4 предполагает прямой эффект. Также в тексте упоминается тот факт, что в mutS были обнаружены только точечные мутации и отсутствие инактивации, также является аргументом в пользу более сложного эффекта, чем просто увеличение скорости мутаций. (инактивация должна иметь гораздо больше шансов произойти (хотя некоторые делеции могут не быть обнаружены на уровне популяции с использованием используемого конвейера), и, поскольку они имеют впечатляющее преимущество в конкуренции, они должны немедленно вторгнуться…

Даже в очень хороших экспериментах, связывающих смертность и частоту мутаций, 10-кратное снижение частоты мутаций от IM2 к IM3 приводит к двукратному или меньшему снижению смертности мертвых клеток.Так что скорость мутации — не единственный игрок. Накопление мутации могло привести к незначительным различиям между IM2 и IM3, но на рисунке 7 автор обнаружил, что трехкратное изменение частоты мутаций на этот раз оказывает сильное влияние на выживаемость (более чем в 10 раз). совершенно разные.

Может быть чрезвычайно сложно следовать механистическим эффектам, но обсуждение того, что в игре могут иметь место как первичный отбор, так и отбор второго порядка, принесет пользу статье.

Было показано, что MMR полезен, потому что они позволяют быстрое переключение экспрессии жгутиков, хотя и повышенная рекомбинация, оказались токсичными, когда в клетке присутствует слишком много несовпадений, так что они приводят к двухцепочечному разрыву … и несколько других недавних в работах было высказано предположение, что эволюция скорости мутации также может быть связана с прямым эффектом. Это никоим образом не снижает ценности проведенных экспериментов, но стоит упомянуть в обсуждении.

Мы благодарим рецензента за такую ​​интерпретацию данных и за его очень интересное предложение о роли возможных прямых эффектов MMR на селекцию гипермутации при высоком этанольном стрессе. Мы включили в рукопись подробное обсуждение возможных эффектов директ.

«[…] Эти данные указывают на то, что преимущество гипермутации при этанольном стрессе можно отнести, главным образом, к отбору второго порядка, вслед за благоприятными эффектами новых мутаций по сравнению с возможными прямыми эффектами самой мутации-мутатора.[…] »

«[…] Однако следующие элементы в наших результатах могут также указывать на потенциальные прямые эффекты мутаторных мутаций. Во-первых, в генах репарации ошибочного спаривания были идентифицированы в основном точечные мутации (рисунок 2 — рисунок в приложении 3), хотя инактивация гена более вероятна, учитывая высокое конкурентное преимущество штамма Δ mutS по сравнению со штаммом mutS _{Штамм G100A} в присутствии 5% этанола (Рисунок 4 — приложение 1 к рисунку). Это дало бы предположить выбор конкретных изменений в механизме пути репарации ошибочного спаривания.Во-вторых, штаммы Δ mutS и mutS _G100A по-прежнему увеличивают частоту при конкуренции с диким типом в соотношении 1: 1000 или ниже (рис. 4). Учитывая 10-50-кратное увеличение частоты мутаций, субпопуляция мутаторов с соотношением 1: 1000 или ниже должна быть слишком маленькой, чтобы иметь повышенный шанс приобретения полезной мутации по сравнению с субпопуляцией дикого типа. Эти данные свидетельствуют о прямом положительном влиянии мутаций MMR (Cooper, et al., 2012; Торрес-Барсело, и др. , 2013; Nowosielska and Marinus, 2007), которые в сочетании с отбором второго порядка могут объяснить наши наблюдения. Кроме того, мы подтвердили, что любое увеличение частоты мутаций, независимо от нарушенной клеточной системы, может дать селективный эффект. Следовательно, эти прямые эффекты, которые обычно являются результатом сбоев в одной конкретной системе или даже в одном гене, могут не напрямую влиять на ранний отбор гипермутации, но могут быть очевидны по стоимости на более поздних стадиях.[…] »

«[…] Некоторые прямые эффекты уже накопленных мутаций могут объяснить несоответствие между 2-кратной разницей в смертности между IM2 и IM3 с 10-кратной разницей в частоте мутаций (Рисунок 6) и более чем 10-кратной разницей в смертность между END и END Δ mutS только с 2,5-кратной разницей в частоте мутаций (фиг. 7). […] »

Следует отметить, что в отношении потенциального роста мутаторов, эксперименты с подмножеством мутаторов, участвующих в различных механизмах, несомненно, являются доказательством того, что выбрана повышенная частота мутаций.Тогда тот факт, что обнаружены только клоны MMR, а нокаут не обнаружен, предполагает, что в конечном итоге происходит выбор более умеренных эффектов или некоторых конкретных механизмов.

Помимо возможных прямых эффектов, описанных выше, которые могут привести к прямому отбору в основном мутаторов MMR, точечные мутации в генах MMR также могут быть выбраны, потому что они лишь умеренно увеличивают скорость мутаций по сравнению со скоростью мутаций, вызванных полным нокаутом. out (рисунок 4). Это позволяет предположить, что умеренно повышенная частота мутаций более полезна, поскольку они имеют более низкую стоимость на более поздних стадиях по сравнению с вариантами с более высокой частотой мутаций.Чтобы уточнить этот момент, мы добавили параграф по этому поводу в наш раздел «Обсуждение»:

«[…] Оба этих наблюдения подтверждают идею о том, что умеренные мутаторы будет легче отбирать, потому что их польза выше, чем у вариантов с низкой частотой мутаций, а их долгосрочная стоимость ниже, чем у вариантов с высокой частотой мутаций. Идентификация в основном точечных мутаций, приводящих к аминокислотным изменениям, а не к бессмысленным мутациям в генах MMR во время эволюции, аналогичным образом предполагает отбор на умеренное увеличение скорости мутаций (например, показано для мутанта mutS _G100A ).[…] »

Рецензент № 3:

[…]

У нас есть три основных комментария:

Существенная информация отсутствует в нескольких местах, что мешает как базовому пониманию динамики популяции во время эксперимента, так и сравнению текущих результатов с результатами предыдущей работы по эволюции частоты мутаций. Во-первых, не дается никакой информации об эффективном размере популяции развивающихся популяций: какие объемы культур, какие разведения, какие конечные плотности клеток были получены и каков был эффективный размер популяции (~ размер посевного материала x количество поколений за цикл роста)?

Мы включили в рукопись всю запрошенную информацию.

«[…] Объем культуры во время эксперимента по эволюции составлял 50 мл, а разведение было 100-кратным при каждом переносе […]».

«[…] Минимальная оптическая плотность 0,2 соответствует минимальной конечной плотности клеток 5,4х10 ⁸ КОЕ / мл в объеме 50 мл. Соответственно, для каждого пассажа мы переносили 500 мкл или не менее 2,73х10 ⁸ КОЕ. Среднее количество поколений для каждого цикла роста, рассчитанное на основе оптической плотности, достигнутой при переносе, составляет 6,67.Это значение соответствует теоретическому значению, полученному из log ₂ (коэффициент разбавления (100)) = 6,67. Взяв эти значения вместе, мы можем рассчитать предполагаемый эффективный размер популяции: 1,82×10 ⁹ КОЕ. […] »

Во-вторых, как было подсчитано количество поколений, учитывая высокую смертность клеток? Были также получены мертвые клетки, и их следует принимать во внимание при оценке общего числа поколений.

Число поколений было рассчитано на основе оптической плотности, измеренной в каждый промежуточный момент времени.Сначала мы рассчитали соответствующее количество КОЕ / мл для измеренной оптической плотности, используя уравнение, полученное из стандартной кривой OD ₅₉₅ -КОЕ / мл. Используя это значение КОЕ / мл, мы рассчитали общее количество КОЕ, присутствующих в объеме культуры 50 мл. Поскольку мы разбавляли 100x при каждом переносе, мы могли использовать общее количество КОЕ с предыдущей временной точки для расчета размера инокулята. Наконец, увеличение количества КОЕ рассчитывали путем деления окончательного количества КОЕ на засеянное количество КОЕ.База логарифма 2 этого значения дает количество поколений (см. Подраздел «Экспериментальная эволюция и уравнение 3, Материалы и методы»).

Хотя это значение является хорошим приближением количества поколений, поскольку измерения OD также регистрируют мертвые клетки, мы знаем, что это вычисленное значение не учитывает конкретно образование мертвых клеток. Поэтому мы добавили к рукописи параграф, объясняющий, как мы оценивали количество поколений, упоминая при этом проблему неизвестной смертности населения.

«[…] Количество жизнеспособных клеток оценивали с использованием значений оптической плотности (A _{595 нм} ). Этот расчет специально не учитывает уровень смертности клеток. Однако, поскольку оптическая плотность отражает как живые, так и погибшие клетки в культуре, расчет количества поколений с использованием значений OD является более точным по сравнению с расчетами, основанными на подсчете КОЕ. Действительно, при использовании данных подсчета жизнеспособных клеток IM1, IM2 и IM3 (рисунок 5) мы обнаружили 1,27-кратное (± 0.29) занижение количества поколений при использовании количества жизнеспособных клеток по сравнению с использованием значений OD. […] »

Рисунок 6 — приложение к рисунку 1B показывает, что OD уменьшается только в поздней стационарной фазе, когда большая часть популяции уже мертва. Учитывая тот факт, что мы переносили культуры во время эксперимента по эволюции в экспоненциальной фазе при OD не менее 0,2, эта плотность, вероятно, отражает все клетки, как живые, так и погибшие в культуре. Следовательно, поколения, рассчитанные на основе этих значений плотности, будут точно соответствовать истинному количеству поколений.Тем не менее, чтобы рассчитать точное количество поколений, нам нужно будет измерить уровень смертности для каждой временной точки отдельно и дополнить модель роста компонентом уровня смертности. Учитывая детальный характер таких экспериментов, это было бы практически невозможно в разумные сроки.

В-третьих, и это, возможно, наиболее важно, было неясно, проводились ли тесты флуктуации и анализ последовательности генома на индивидуальных клонах или смешанных популяционных образцах. В результате мы не знаем, как интерпретировать рисунок 5 и таблицу 1: отражают ли показатели мутаций на рисунке 5 скорость мутаций фиксированных генотипов или это сочетание скорости мутаций мутаторов и мутаций дикого типа в полиморфной популяции? Сходны по частоте наблюдаемых мутаций в таблице 1: основаны ли они на последовательностях случайных клонов, выбранных из этих популяций, или на ДНК смешанных популяций? Различия в скорости мутаций, показанные на рисунке 5A, предполагают, что они отражают скорость популяционных мутаций, поскольку изменения слишком малы, чтобы отражать чисто генотипические эффекты, если они включают мутантные мутанты, такие как mutS (см. Рисунок 4).Это различие имеет решающее значение для возможных механизмов, которые следует учитывать для объяснения динамики скорости мутаций: если в популяции фиксируются генотипы с высокой частотой мутаций, то наблюдаемые позже генотипы с низкой частотой мутаций должны происходить от прежних генотипов, тогда как если они * не * фиксированный, позже наблюдаемые генотипы с низкой частотой мутаций могут происходить от предковых генотипов, которые все еще присутствовали в популяции, когда измерялось увеличение частоты мутаций.

Все анализы флуктуаций проводились на смешанных выборках населения.Следовательно, одним из возможных способов объяснения быстрого снижения частоты мутаций является сдвиг в структуре популяции, когда субпопуляция с еще присутствующей частотой мутаций дикого типа снова фиксируется в популяции. Однако анализ секвенирования в смешанных пулах с использованием низкочастотного вызывающего варианта (CLC Genomics Workbench) показал, что все обнаруженные мутации мутатора восстановления несоответствия (показаны на рисунке 2 — рисунок в приложении 2) стали на 100% фиксированными в популяции и оставались фиксированными даже после уменьшения в скорости мутации не наблюдалось.Следовательно, генотипы с низкой частотой мутаций должны были возникнуть из генотипов с высокой частотой мутаций. Следовательно, отбор генотипов с низкой частотой мутаций должен приводить к быстрому снижению частоты мутаций, наблюдаемому в периоды, когда концентрации этанола оставались постоянными. Скорость фиксации мутанта с более низкой частотой мутаций и более низкой смертностью может быть увеличена за счет более низкой продукции мертвых клеток и, следовательно, более быстрого увеличения доли в популяции по сравнению с популяцией с высокой частотой мутаций и высокой смертностью.

Кроме того, мы оба секвенировали смешанный пул и один выбранный клон из каждого пула. Таблица 1 теперь заменена рис. 2 — дополнением к рисунку 2, на котором представлены мутации, обнаруженные в образце смешанного пула. Показано как общее количество вариантов (частота> 10%) в каждом пуле, так и количество «фиксированных» (частота> 75%) мутаций. Теперь мы специально добавили в рукопись упоминание о частоте популяционных мутаций, чтобы прояснить происхождение данных о частоте мутаций. Кроме того, мы добавили параграф, объясняющий важность интерпретации данных.

«[…] Следовательно, частота мутаций в популяции будет отражать среднюю скорость геномных мутаций для всей популяции, содержащей различные субпопуляции, которые, возможно, демонстрируют частоту мутаций выше или ниже среднего. Это может объяснить несоответствие между 20-кратным увеличением частоты мутаций конечной точки линии E1 (рис. 3A) и 10-кратным увеличением частоты клональных мутаций, вызванных мутацией mutS _G100A , идентифицированной в той же линии (рис. 4A). Более того, эти данные предполагают, что частота мутаций может изменяться вместе со структурой популяции на протяжении эволюции, а не быть фиксированной скоростью после возникновения и распространения одной мутации-мутатора.[…] »

Наш второй комментарий касается удивительно быстрого отбора генотипов с более низкой частотой мутаций в несколько раз в течение эволюции (рис. 5). Как показано выше, чтобы понять, вызвал ли естественный отбор эти изменения (и если предположить, что они отражают скорость мутаций популяции, а не отдельных клонов!), Необходимы две части информации. Во-первых, последствия этих изменений для приспособленности должны быть количественно определены в экспериментах по прямой конкуренции между генотипами с высокой и низкой частотой мутаций в условиях, преобладающих в ходе эволюции.Теперь сравнивается только производство мертвых клеток (рис. 6), но не предпринимается попыток перевести оценки смертности в значения приспособленности ни эмпирически (путем проведения этих соревнований), ни теоретически (с использованием моделей роста для прогнозирования этих эффектов). Снижение частоты мутаций в течение 150 поколений продолжающейся эволюции популяции E9 (рис. 7) и его корреляция с более низкой продукцией мертвых клеток наводят на размышления, но не решают загадки, как показатели смертности трансформируются в приспособленность в условиях отбора.Во-вторых, оценки пригодности генотипов с высокой и низкой частотой мутаций следует затем использовать для прогнозирования динамики снижения частоты мутаций, чтобы увидеть, действительно ли этот механизм может объяснить динамику, показанную на рисунке 5.

В процессе эволюции мы постоянно увеличивали процентное содержание этанола. Поскольку IM2 и IM3 могли расти при одинаковом процентном содержании этанола (7,5%), было бы разумно сравнивать эти промежуточные временные точки друг с другом, чтобы определить значения приспособленности, связанные со смертностью.Однако разница в количестве поколений между IM2 и IM3 превышает 70, и вполне вероятно, что за это время накопились другие адаптивные мутации, антимутаторные мутации и дополнительная генетическая нагрузка. По этой причине мы считаем крайне маловероятным, что мы можем напрямую связать значение пригодности в результате конкуренции между IM2 и IM3 со смертностью. Поэтому, чтобы ответить на этот комментарий, мы решили рассчитать теоретические последствия для фитнеса, а не проводить прямые соревнования.

Точный прогноз влияния смертности на приспособленность потребует создания новой модели роста, включающей параметр для учета влияния уровня смертности. Это потребует проведения новых экспериментов для сбора достаточного количества данных для построения и обоснования новой модели и, возможно, даже нового сотрудничества с более теоретически ориентированной лабораторией. Поэтому здесь мы использовали доступные данные и существующие модели роста для моделирования упрощенного соревновательного эксперимента и расчета значения пригодности и количества раундов отбора, необходимых для исправления генотипа с более низкой частотой мутаций в популяции.

Во-первых, мы определили различные параметры роста, такие как скорость роста (GR) и пропускная способность (y0). С этой целью мы использовали время для роста в присутствии 7,5% EtOH и окончательные измерения плотности клеток, полученные в ходе нашего эволюционного эксперимента. Это приводит к следующим параметрам как для IM2, так и для IM3 (таблицы данных доступны по запросу).